柴胡种间序列差异及其遗传分化

何婷婷， 柴军红， 郝婧玮， 陈瑜欣

(1.牡丹江师范学院， 黑龙江 牡丹江 157000； 2.重庆市烟草公司彭水分公司， 重庆 彭水 409600)

柴胡属(Bupleurum)，隶属于伞形科(Umbelliferae)，多年生草本，是双子叶植物中的大属之一。据报道，全世界约有柴胡属植物200余种，我国已报道的有36种、17个变种以及7个变型[1]。柴胡主要分布于北半球亚热带地区。在中国，多产于湖北、四川等地。柴胡又名地熏，茈胡，山菜等。

药用价值方面的研究表明，柴胡可抗菌[2]、抗癌[3]、保肝护肝[4]、利胆[5]等。此外，舒璞等[5]通过数量分类学的方法对柴胡属植物进行了分类方面的研究，更新了中国柴胡分类系统，其中大柴胡被单独列为一个亚属并且命名为大叶柴胡亚属，而其他柴胡属植物命名为真柴胡亚属。Liu等研究了不同的海拔高度对台湾柴胡生长发育的影响，结果表明，高海拔地区的柴胡叶片和根的长度较大，低海拔下植株高度、根径大小、根的重量和皂甙含量均较高[6]。

rDNA 基因中，5.8 S和28 S基因间隔的序列称为内转录间隔区(Internal Transcript Spacer, ITS)，其长度和序列变化非常大，该片段是由ITS 1、5.8 S和ITS 2三个区域组成，其中ITS 1和ITS 2在不同植株中变化较大，承受较小的选择压力；5.8 S区域在不同植株中的变异较小，较为保守，因此，可利用该区域鉴别不同植株间的亲缘关系[7]。目前，ITS应用在较多的植物物种中，农作物[8-12]、果蔬[13-16]、花卉[17-19]中均有涉猎。但在中药研究中应用较少。

之前对于柴胡的研究主要集中在药用价值方面，且柴胡作为常用中药，需求量随之增加，导致柴胡供不应求，市场混乱，真假难辨。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本研究选用柴胡属10个种及1个外类群鞘山穹，详细信息见表1。

1.2 实验方法

本研究所需序列全部来自于NCBI数据库，将下载序列保存为文本文档格式，然后利用在线对比软件(http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/)进行序列比对，分析序列的差异性，整理差异碱基的变异类型，并作出折线图。利用clustalX 1.83软件对序列进行对比，后转化为meg格式，进行遗传距离的计算和系统聚类分析。

表2 不同样本的序列分析

样品编号 ITS ITS1 5.8S ITS2 长度/bpGC含量/%长度/bpGC含量/%长度/bpGC含量/%长度/bpGC含量/%160458.9421464.0216353.3722758.15260458.6121463.5516353.3722757.71360658.9121461.6816353.3722960.26460658.5821462.1516353.3722958.95560058.5021460.7516353.3722360.09660556.8621260.3816352.1523056.96760458.2821360.5616353.3722859.65860658.7521462.1516353.3722959.39959957.7620959.8116352.7622759.471060558.1821461.2116353.3722858.77

表3 10个柴胡属种的ITS遗传距离分析

样品编号123456789101110.00020.0070.00030.0280.0320.00040.0280.0320.0180.00050.1060.1060.0960.1020.00060.0280.0210.0540.0540.1300.00070.0980.0980.0940.1000.0560.1220.00080.0260.0300.0160.0020.1000.0520.0980.00090.1020.1020.0940.0980.0300.1220.0460.0960.000100.0320.0350.0170.0170.1020.0570.1040.0190.1010.000110.3160.3190.3140.3140.3270.3420.3220.3170.3240.3180.000

注：11为鞘山芎。下同。

2 结果与分析

2.1 柴胡样本间的序列分析

2.1.1样本间碱基变异性研究

10个样品柴胡种间碱基的颠换/转换比值存在较大差异，其中出现两个峰值，分别对应的是紫花鸭跖柴胡和黑柴胡，说明两者碱基发生颠换的数量远远高于转换(图1)。

2.1.2样本间GC含量分析

10个柴胡样品的ITS全长在599～606 bp之间，其中5.8S的区段长度一致，个别样品的GC含量有轻微减少，其余样品的GC含量一致，说明该区段较为保守。ITS 1和ITS 2区段的序列长度及GC含量均存在一定程度的变异，说明这两个区段内的核苷酸较为多变，能够提供较为丰富的变异位点(表2)。

注：1为北柴胡；2为银州柴胡；3为红柴胡；4为紫花鸭跖柴胡；5为竹叶柴胡；6为马尔康柴胡；7为小柴胡；8为黑柴胡；9为有柄柴胡；10为大叶柴胡。下同。

2.2 遗传距离分析

10个样本间的遗传距离在0～0.130之间(表3)，北柴胡和银州柴胡；红柴胡和紫花鸭跖柴胡、黑柴胡、大叶柴胡两两间的遗传距离相对较小，在0.002～0.019之间，其中紫花鸭跖柴胡与黑柴胡间遗传距离最小，仅有0.002。

图2 10个柴胡种ITS系统发育分析

北柴胡和竹叶柴胡、小柴胡、有柄柴胡；银州柴胡和竹叶柴胡、小柴胡、有柄柴胡；红柴胡和紫花鸭跖柴胡、小柴胡、有柄柴胡；紫花鸭跖柴胡和竹叶柴胡、小柴胡、有柄柴胡；竹叶柴胡和马尔康柴胡、黑柴胡、大叶柴胡种间的遗传距离表现得相对较大，在0.094～0.130之间，其中竹叶柴胡和马尔康柴胡种间的遗传距离最大，达0.13。

以上结果均表明，本研究所选用的10个柴胡种间的遗传距离存在显著差异，各种间遗传距离跨度较大，说明柴胡种间序列差异较大。

2.3 柴胡种间亲缘关系分析

由图2可知，本研究中所采用的10个柴胡种主要分成两大分支：

第一大分支包含小柴胡、竹叶柴胡与有柄柴胡。其中竹叶柴胡和有柄柴胡在同一个小分支中，同源性较高，达到94%，推测竹叶柴胡和有柄柴胡可能来自同一个祖先。

第二大分支又分为2个小的分支，分支Ⅰ中的柴胡种有北柴胡、银州柴胡和马尔康柴胡，而北柴胡和银州柴胡的亲缘关系又较为亲近，同源性达到97%；而分支Ⅱ中的红柴胡、大叶柴胡虽然和黑柴胡与紫花鸭跖柴胡(黑柴胡与紫花鸭跖柴胡的同源性高达99%)在同一个大分支中，但是又各自单独在一个分支内，说明红柴胡、大叶柴胡同黑柴胡与紫花鸭跖柴胡等其他种间仍然存在一定差异。而与10个柴胡属同科的植物鞘山芎另成一个大分支，表明鞘山芎与10个柴胡属植物差异很大。

3 讨 论

柴胡是常见中药，目前对于柴胡的研究多集中在其活性成分及其药用价值上，对不同柴胡种间亲缘关系及在某一基因上的序列差异的相关研究较少。本研究对10个柴胡种在ITS基因位点上的序列进行亲缘关系的相关研究，发现个别种的归属与中国植物志上的分类存在一定差异。本研究结果显示，有柄柴胡与竹叶柴胡的序列差异性较小，同源性高达94%；而在中国植物志中，有柄柴胡与紫花鸭跖柴胡由于茎基部非木质化，叶非椭圆形而聚为一类，但二者之间也存在形态上的细微差异，例如茎生叶是否存在柄，具有几片总苞片。此外，银州柴胡的归属也存在细微差异，本研究结果显示其与北柴胡的亲缘关系较近，而中国植物志中银州柴胡与红柴胡的亲缘关系较近，叶均为线形，根表面均为淡红棕色。

柴胡作为常用药，对流感、感冒等上呼吸道感染有较好疗效。本属中作为中药原料的约有20余种，其中北柴胡、银州柴胡、红柴胡等具有代表性[1]。杜江对柴胡的转录组进行研究，结果表明，只有59.06%的Unigene获得了不同数据库的注释，另外没有注释到的基因可能是由于其物种的相关研究信息较少，可参考的数据匮乏所致[20]。这就需要后续的深入研究，对未注释到的基因进行深度的生物信息学分析，以期为柴胡种的分类、功能基因的开发利用提供前期数据支撑[20]。