携RGD靶向肽载紫杉醇高分子超声造影剂制备及其对乳腺癌细胞靶向能力、抗肿瘤效应评估

李娟，刘桂荣，秦颢诚，武俊

1连云港市第二人民医院，江苏连云港 222000；2连云港市第一人民医院；3大连医科大学附属第二医院

目前，乳腺癌的治疗方式以手术为主、放化疗等为辅；然而，传统抗肿瘤药物血药浓度不稳定，半衰期短，不良反应大，严重影响了其疗效。随着纳米技术研究的深入，靶向给药纳米粒系统在改善抗肿瘤药物不良反应和耐药性等方面具有独特优势。纳米粒通过高通透、高滞留效应实现肿瘤被动靶向［1］，同时在纳米粒表面修饰的靶向分子可以使其获得主动靶向能力，内部包载显像剂及药物可实现肿瘤的早期影像学诊断及可视化治疗。研究显示，αvβ3整合素受体在某些侵袭性肿瘤如乳腺癌、黑色素瘤等呈过表达，具有精氨酸—甘氨酸—天门冬氨酸（RGD）肽段的RGDfK可与其特异性结合，提高纳米粒的肿瘤主动靶向能力［2-3］。2018年7月—2020年6月，我们选用普通造影剂聚乳酸—羟基乙酸（PLGA）为成膜材料，采用双乳化法及碳二亚胺法制备携RGD靶向肽的载紫杉醇（PTX）超声造影剂，观察其体外对乳腺癌细胞的靶向能力、细胞杀伤效率及超声造影情况。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 羟基端乳酸—羟基乙酸共聚物（PLGA-COOH，聚合比例75∶25）；PTX（上海源叶有限公司）；MES缓冲液（pH 5.5/8.0）、偶联活化剂（EDC、NHS）及荧光染料DiⅠ、DAPI（Sigma，美国）；FITC标记的RGDfK肽（武汉博士德生物工程有限公司）；人乳腺癌细胞MBA-MD-231（蚌埠医学院病理教研室提供）；VCY-500超声波处理器（上海标本模型厂）；M S2000激光粒度分析仪（Malvern，美国）；LSM 900激光共聚焦显微镜（ZEISS，德国）。

1.2 实验方法

1.2.1 靶向载药造影剂PTX-PLGA-RGDfK的制备 将100 mg PLGA-COOH及10 mg PTX完全溶于2 mL二氯甲烷中，另加入0.2 mL双蒸水，冰浴下声振120 s（100 W，on 4 s/off 2 s）；加入4%PVA溶液5 mL，再次声振90 s（75 W，on 4 s/off 2 s）；加入2%异丙醇溶液20 mL，室温下搅拌3 h得载药造影剂（PTX-PLGA）。将10 mg PTX-PLGA溶解于适量MES缓冲液（pH 5.5）中，加入适量偶联活化剂EDC和NHS（摩尔浓度比为2∶5），振荡孵育0.5 h；多次离心洗涤后，重悬于MES缓冲液（pH 8.0）中；加入适量FITC-RGDfK（RGDfK肽终浓度为1.0 mmol/L），冰浴下振荡孵育1～2 h；双蒸水多次离心洗涤，冷冻干燥，充入氟碳气体得PTX-PLGA-RGDfK冻干粉。

1.2.2 PTX-PLGA-RGDfK一般性质检测 光镜下观察PTX-PLGA-RGDfK的形态，马尔文激光粒径仪检测其粒径分布及表面电位，高效液相色谱法测定PTX在PTX-PLGA-RGDfK及体外缓释液中的含量。检测条件：流动相甲醇与水比例为77∶23，波长227nm。样品处理方法：称取10 mg PTX-PLGA-RGDfK充分溶解于0.5 mL二甲亚砜中，以2.5 mL甲醇溶解萃取紫杉醇，经0.22μm PVDF膜过滤，取20μL进样。包封率及载药量计算：包封率=（Cm/Ct）×100%；载药量=（Cm/WT）×100%；其中Cm为载入PTX-PLGA-RGDfK中PTX的质量；Ct为原料内PTX的用量，WT为PLGA-COOH的用量。

1.2.3 PTX-PLGA-RGDfK体外释药能力观察 将10 mg PTX-PLGA-RGDfK充分溶解于2 mL PBS缓冲液（pH 7.4），转移至透析袋（截留分子量为8 kD）后浸没于150 mL缓释介质中，于37℃120 r/min恒温振荡器内持续震荡；分别于0.5、1、2、3、4、6、8、10、12、24、48、72 h取样1 mL，并补加同体积缓释介质，经0.22μm PVDF膜过滤；取20μL进样，计算PTX-PLGA-RGDfK的药物累积释放百分率，并绘制释放时间曲线。

1.2.4 PTX-PLGA-RGDfK表面FITC-RGDfK连接及体外乳腺癌细胞靶向情况观察 联合使用激光共聚焦显微镜及流式细胞仪检测PTX-PLGA-RGDfK表面FITC-RGDfK的连接情况，激光共聚焦显微镜下经DiⅠ染色的PTX-PLGA-RGDfK造影剂表现为红色荧光、FITC-RGDfK发出绿色荧光、图像叠加后呈黄色荧光，流式细胞仪测算靶向造影剂表面FITC-RGDfK的平均结合率。另取适量对数生长期的MBA-MD-231细胞接种6孔板，分为A、B两组；待细胞全部贴壁并生长到适量密度，A、B组分别加入经DiI处理的PTX-PLGA及PTX-PLGA-RGDfK，继续孵育2 h；每孔加入适量4%多聚甲醛固定液固定15 min，再以适量DAPI进行细胞核染色，于激光共聚焦显微镜下观察体外细胞靶向情况。DAPI染色的细胞核发出蓝光荧光，如细胞周围可见大量红色荧光靶向造影剂则表示靶向成功。

1.2.5 PTX-PLGA-RGDfK体外乳腺癌细胞毒性观察 将处于对数生长期的MBA-MD-231细胞以5×103/孔接种96孔板，恒温培养箱中继孵育24 h。将上述细胞分为4组，每组分别设置8个平行复孔；对照组不作处理，PLGA组、PTX-PLGA组、PTX-PLGARGDfK组分别加入PLGA、PTX-PLGA、PTX-PLGARGDfK，调整其纳米粒浓度分别为0.5、1.5、2.5、5.0 mg/mL，各组孵育2 h；PBS冲洗5次，加入新鲜培养基继续培养24 h；采用CCK-8法检测各组细胞存活率。设定对照组细胞生存率为100%，计算实验组细胞活性率。细胞活性率（%）=实验组OD值/对照组OD值×100%。

1.2.6 体外显影情况观察 将PTX-PLGA-RGDfK充分溶于双蒸水，调整浓度至3 mg/mL；取2 mL于百胜Mylab 90彩色多普勒超声诊断仪造影模式下观察造影剂体外显影情况，以脱气水作为对照。

1.2.7 统计学方法 采用SPSS22.0统计软件。计量资料以±s表示，两组间比较采用两独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PTX-PLGA-RGDfK的一般性质 PTX-PLGARGDfK水溶性较好，大小较均一（见图1A），粒径为（326.24±56.63）nm（见 图1B），表 面 电 位为-11.4 mV（见图1C）。PTX的包封率为82.10%±2.12%，载药量为8.21%±0.21%。

2.2 PTX-PLGA-RGDfK体外释药能力 PTXPLGA-RGDfK在最初的12 h内药物突释，释放量达46.59%±1.83%；随后出现平稳的缓慢释放，72 h后释放率达73.26%±1.98%。见OSID码图1。

2.3 PTX-PLGA-RGDfK表面FITC-RGDfK连接及体外乳腺癌细胞靶向情况 流式细胞仪检测显示，靶向造影剂表面FITC-RGDfK结合率达95.28%±0.37%（见OSID码图2）。激光共聚焦显微镜下，两组DAPI染色的乳腺癌细胞核发出蓝光荧光，A组乳腺癌细胞周围仅见极少红色荧光非靶向造影剂（OSID码图3A），而B组乳腺癌细胞周围可见大量红色荧光靶向造影剂（OSID码图3B）。

图1 PTX-PLGA-RGDf K的一般性质

2.4 PTX-PLGA-RGDfK体外乳腺癌细胞毒性 与PLGA组同浓度比较，PTX-PLGA组、PTX-PLGARGDfK组细胞存活率降低，且PTX-PLGA-RGDfK组低于PTX-PLGA组（P均＜0.05）。见图2。

图2 不同造影剂不同浓度下对乳腺癌细胞活性的影响（CCK-8法）

2.5 PTX-PLGA-RGDfK体外显影情况 PTXPLGA-RGDfK体外显影成像效果较好，回声均匀细腻；脱气水对照无回声，无增强显影。见OSID码图4。

3 讨论

目前，临床常用超声造影剂粒径都在1μm以上，属于血池显像剂，无法穿过血管内皮间隙渗透至肿瘤组织内，存在一定的局限性。纳米载药系统是指粒径在10～1 000 nm的内部或表面包封或修饰药物的固态胶体颗粒［4］，由纳米尺度引起的高通透强滞留效应简称EPR效应，可使大分子类物质和脂质颗粒更易进入血管丰富、血管壁间隙较宽、结构完整性差的实体肿瘤内并长期蓄积，有效克服了传统化疗药物在肿瘤部位低蓄积、生物利用度差、不良反应大等缺点，实现纳米粒的肿瘤被动靶向［5-6］。尽管如此，肿瘤的异质性和多药耐药等使被动靶向效果仍差强人意。因此，在纳米粒表面修饰靶向分子如抗体、肽、小分子等使纳米粒获得主动靶向能力，再装载对比显像剂及药物，从而实现肿瘤的早期诊断及可视化的靶向治疗，或可成为新的研究方向。

PTX可促进微管聚合并稳定已聚合的微管［7］，是乳腺癌化疗的主要药物之一；但该药对肿瘤细胞并无特异性，且使用时需有机溶剂溶解，进一步增加了其不良反应；以纳米制剂包裹PTX，可增加药物在肿瘤内的浓度，提高对肿瘤组织的靶向性，减少不良反应［8-9］。PLGA是一种可降解的高分子有机化合物，其生物相容性好、稳定性高且无毒，具有包裹药物和免疫抗原的能力，已被诸多学者用作药物和基因递送的载体材料［10-11］。PLGA包载PTX形成纳米颗粒，能保护其生物活性，延长药物在体内的半衰期，这对于长期用药者具有重要的临床意义［12］。本研究中制备的靶向载药造影剂粒径为（326.24±56.63）nm，可有效穿过肿瘤血管内皮间隙，弥散至肿瘤组织间隙。该造影剂药物的包封率为82.10%±2.12%，载药量为8.21%±0.21%。体外释放实验显示，在最初的12 h药物的突释作用较强，达到46.59%±1.83%，其原因主要为这部分药物是黏附于造影剂表面或未被严密包裹进去的PTX突释引起的；12 h后药物释放速率减慢，趋于平缓，72 h后药物释放量达73.26%±1.98%。

整合素是一种由两个异二聚体非共价连接的跨膜糖蛋白，可介导细胞—细胞和细胞—细胞外基质的相互黏连和双向信号传递。迄今已发现24种整合素，其中整合素αvβ3的研究最广泛［13-14］，它可特异性识别RGD三肽序列。研究表明，αvβ3整合素受体在乳腺癌、骨肉瘤和恶性黑色素瘤中过表达［2-3］，可通过具有RGD肽段的RGDfK作为肿瘤靶向肽，与αvβ3整合素受体特异性结合，提高纳米粒的肿瘤靶向性。本研究成功制备出携RGDfK的载PTX造影剂，该造影剂可特异性结合到人乳腺癌细胞MBA-MD-231表面，其细胞毒性高于单纯载药造影剂，抗肿瘤效应得到大幅度提升；并且，该造影剂体外显影实验可见超声造影模式下，造影剂成像效果较好，内部回声均匀细腻。

综上所述，本研究成功构建了携RGDfK载PTX靶向超声造影剂，该造影剂药物包封率及载药量较高，且具有一定的药物缓释效应及较好的乳腺癌细胞靶向能力；同时，其体外抗肿瘤细胞效应明显，体外显影效果较好，为进一步开展体内靶向抗肿瘤效应及肿瘤显影研究提供了前期实验基础。