寻常型银屑病患者外周血Th17/Treg及负性共刺激因子水平变化及意义

张凯辉，段行武，陈曦，张润田

1北京中医药大学第一临床医学院，北京 101100；2北京中医药大学东直门医院

寻常型银屑病（PV）为临床常见慢性复发性炎症性皮肤病，发病原因尚未完全明确，临床干预仍以对症治疗为主［1-2］。因此，本病病因学的研究不但可进一步明确病因，对临床治疗更具有重要指导意义。临床普遍认为，PV为多基因遗传背景下的免疫性疾病，T淋巴细胞免疫功能紊乱为PV发病的关键环节［3］。调节性T淋巴细胞（Treg）为近年来发现的具有显著免疫抑制作用的CD4+T淋巴细胞亚群，对预防自身免疫性疾病具有重要作用［4］。有研究表明［5］，PV患者辅助性T淋巴细胞17（Th17）数量及其分泌的细胞因子白细胞介素17（IL-17）较健康人群升高。薛潇春等［6］实验发现，小鼠外周血辅助性T淋巴细胞中程序性死亡因子1（PD-1）及配体（PDL1）水平降低，可能引起小鼠免疫细胞失衡，导致或加重PV。本研究探讨了PV患者外周血Th17/Treg及负性共刺激因子水平变化，旨在为寻找新的免疫治疗靶点提供依据。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 经北京中医药大学东直门医院医学伦理委员会批准，选取2018年1月—2020年8月我院收治的PV患者35例（观察组）及体检健康者35例（对照组）。纳入标准：①观察组符合《中国银屑病诊疗指南（2018完整版）》中PV诊断标准［7］；对照组无免疫性、系统性疾病，无银屑病家族史；②临床资料完整；③受试者知情同意。排除标准：①近2个月内曾服用免疫抑制剂、维A酸类、皮质类固醇激素药物；②孕妇及哺乳期；③伴有红斑狼疮等自身免疫性疾病；④入组前1个月内曾接受外用药物治疗、紫外线及光化学疗法等物理治疗；⑤合并扁桃体炎、上呼吸道感染、炎性肠病等其他疾病；⑥合并其他皮肤病。观察组男19例、女16例，年龄（39.65±11.84）岁；BMI为过轻6例、正常23例、超重4例、肥胖2例；饮酒22例、不饮酒13例，吸烟16例、不吸烟19例；已婚20例、未婚15例；PV面积与严重程度指数（PASI）评分［8］（24.68±7.19）分，≤24分（轻度）19例、＞24分（中重度）16例。对照组男17例、女18例，年龄（41.69±10.65）岁，BMI为过轻8例、正常20例、超重5例、肥胖2例；饮酒18例、不饮酒17例，吸烟10例、不吸烟25例；已婚24例、未婚11例。除PASI外，两组年龄、性别、BMI等基本资料具有可比性。

1.2 标本采集与处理 于清晨采集观察组治疗前和对照组空腹静脉血5 mL，分为两等份。一份置于肝素钠抗凝管内，用于流式细胞仪检测Th17细胞和Treg细胞；另一份以2 000 r/min离心20 min，取上层血清，采用密度梯度离心法提取外周血单个核细胞（PBMC），用于PCR检测负性共刺激因子PD-1、PDL1 mRNA。

1.3 Treg检测方法 取试管2支，均加入肝素钠抗凝血100μL，加入CD25-PE、CD4-FITC各20μL混匀，4℃下避光反应30 min；加入缓冲液2 mL混匀，室温下以2 000 r/min离心5 min，去除上清液，将残留液同细胞混匀；2支试管分别加入新鲜配制的固定/透化液1 mL混匀，4℃下避光反应45 min；再加入1×透化液2 mL混匀，室温下以2 000 r/min离心5 min；重复洗涤细胞2次，末次离心后去除上清液，重悬细胞；2支试管分别加入大鼠血清2μL混匀，4℃下避光孵育15 min，一管加入20μL FoxP3-PECy5，另一管作为对照加入5μL IgG2a-PE-Cy5混匀，4℃下避光反应30 min；加透化液2 mL混匀，以2 000 r/min离心5 min，重复洗涤细胞2遍，第2次离心后去除上清液；加入适量缓冲液混匀，于24 h内上流式细胞仪检测；以CD25、CD4设门区分CD25+、CD4+细胞，再测定FOXP3+细胞，并以散点图表示，以荧光抗体染色阳性细胞百分比记录结果。

1.4 Th17检测方法 将PBMC悬液接种于24孔培养板内，每孔1 mL；每孔加入2μL刺激剂，37℃5%CO2下于培养箱孵育5 h；将细胞悬液置于2支试管内，以2 000 r/min离心10 min，去除上清液，重悬细胞；分别于2支试管内加入500μL破膜剂混匀，4℃下孵育10～15 min；室温下以2 000 r/min离心5 min，去除上清液，重悬细胞；一管加入5μL PerCPCD8a抗体、20μL FITC-CD3、20μL PE-IL-17A，另一管作为对照加入5μL PerCP-CD8a抗体、20μL FITC-CD3、5μL PE-IgG1混匀，4℃下避光孵育30 min；2支试管分别加入PBS缓冲液2 mL，室温下以2 000 r/min离心5 min，去除上清液，重悬细胞；2支试管分别加入PBS缓冲液300～500μL，重悬细胞，24 h内上流式细胞仪检测；以CD3、CD8直方图设门区分出CD3+、CD8+细胞，以散点图表示IL-17+细胞，即CD3+CD8-IL-17+细胞群来代表Thl7细胞，以荧光抗体染色阳性细胞百分比记录结果。

1.5 PD-1、PD-L1 mRNA检测方法 采用RT-PCR检测PBMC中PD-1、PD-L1 mRNA。TRIzol法提取PBMC中总RNA，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成；对提取RNA逆转录合成cDNA进行扩增，PCR反应体系10μL。反应条件：95℃预变性10 min，95℃变性10 s，60℃延伸30 s，共40个循环；每升高1℃采集荧光信号5次，将β肌动蛋白作为内参基因，利用2-ΔΔCt法计算mRNA相对表达量。

1.6 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件。计量资料以-x±s表示，两组数据比较采用独立样本t检验，采用Logistic回归分析各指标与PV发生的关系，采用偏相关性、Pearson相关系数分析指标相关性。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组外周血Th17/Treg、负性共刺激因子水平比较 观察组外周血Th17、PD-L1 mRNA水平高于对照组，PD-1 mRNA水平低于对照组（P均＜0.05）。见表1。

表1 两组外周血Th17/Treg、负性共刺激因子水平比较（±s）

表1 两组外周血Th17/Treg、负性共刺激因子水平比较（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05。

组别观察组对照组n 35 35 Th17（%）3.53±0.55*3.30±0.21 Treg（%）4.29±1.04 3.89±1.12 PD-1 mRNA 0.20±0.11*0.35±0.14 PD-L1 mRNA 2.78±0.91*2.09±0.78

2.2 外周血Th17/Treg、负性共刺激因子水平与PV发生的关系 Logistic回归分析显示，Th17、PDL1 mRNA高于均值者发生PV的风险增加，而PD-1 mRNA高于均值者发生PV的风险降低（P均＜0.05）。见表2。

2.3 不同病情PV患者外周血Th17/Treg、负性共刺激因子水平比较 PV轻度患者外周血Th17、PDL1 mRNA水平低于中重度者，PD-1 mRNA水平高于中重度者（P均＜0.05）。见表3。

表2 外周血Th17/Treg、负性共刺激因子水平与PV发生的关系

表3 不同病情PV患者外周血Th17/Treg、负性共刺激因子水平比较（±s）

表3 不同病情PV患者外周血Th17/Treg、负性共刺激因子水平比较（±s）

注：与轻度患者比较，*P＜0.05。

PV病情轻度中重度n 19 16 Th17（%）3.31±0.22 3.79±0.20*Treg（%）4.35±0.91 4.22±0.98 PD-1 mRNA 0.26±0.08 0.13±0.05*PD-L1 mRNA 2.51±0.52 3.10±0.67*

2.4 PV患者外周血Th17/Treg、负性共刺激因子水平与PASI评分的相关性 相关性分析结果显示，PV患者外周血Th17水平与PASI评分呈正相关（r=0.740，P＜0.01），Treg与PASI评分无相关性（r=-0.264，P=0.126），PD-1 mRNA与PASI评分呈负相关（r=-0.636，P＜0.01），PD-L1 mRNA与PASI评分呈正相关（r=0.726，P＜0.01）。将年龄、性别、体质量指数、饮酒史、吸烟史、合并疾病、疾病类型、Treg等控制后，偏相关性分析显示PV患者外周血Th17、PD-1 mRNA、PD-L1 mRNA仍与PASI评分有关（标准化β分别为8.552、-6.890、8.769，P均＜0.01）。

2.5 PV患者外周血Th17/Treg、负性共刺激因子间的相关性 Pearson相关性分析结果显示，PV患者外周血Th17与PD-1 mRNA呈负相关（r=-0.845，P＜0.01）、与PD-L1 mRNA呈 正 相 关（r=0.653，P＜0.001），Treg与PD-1、PD-L1 mRNA均无相关性（r分别为0.140、-0.063，P均＞0.05）。

3 讨论

PV又称“牛皮癣”，发病周期较长，且难以根除，易复发，发病人群以中青年为主，对患者身心健康造成巨大损害［9-10］。目前，国内外对此病发病原因及机制的研究虽取得一定成就，但仍未得到确切结论。因此，探讨PV病因与发病机制已成为皮肤科领域重要研究课题之一。

大量研究证实［11-12］，PV病理特点为自身反应性T淋巴细胞的持续激活；多数学者认为，PV发病核心为细胞免疫紊乱，尤其同CD4+T淋巴细胞密切相关。吴明顺等［13］发现，活化的CD4+T淋巴细胞根据抗原性质、细胞因子类型不同分为辅助性T淋巴细胞1（Th1）、辅助性T淋巴细胞2（Th2）、Th17、Treg四个细胞亚群。随着研究的深入，发现单纯以Th1/Th2细胞失衡理论，无法完全解释PV免疫发病机制。Th17与Treg的功能和分化过程相互对抗，正常情况下二者保持平衡，以维持机体免疫稳定［14-15］。Th17/Treg失衡的发现可弥补Th1/Th2介导效应机制不足，有助于临床深入研究CD4+T淋巴细胞免疫调节效应，为临床深入研究PV发病机制及治疗开辟新思路。本研究结果发现，与健康人群比较，PV患者外周血Th17水平升高，Treg水平差异无统计学意义；HOHENBERGER等［16］研究亦证实，PV皮损中IL-17水平高于正常皮肤。分析其原因在于：①Th17细胞可产生多种细胞因子如IL-17、IL-26、IL-21、肿瘤坏死因子α（TNF-α）等发挥生物学作用，具有强大的致炎性。已有研究证实，Th17在红斑狼疮、硬皮病等自身免疫性疾病中均有不同程度增加。这提示Th17可能参与PV皮损内中性粒细胞的浸润过程，与PV皮损内角化不全区可见毛细血管扩张、Munro微脓肿，周围可见中性粒细胞、淋巴细胞等浸润的病理特点相符合。②Treg细胞占正常人外周血中CD4+T淋巴细胞的5%～10%，在外周血中数量较少。本研究发现，健康人群与PV患者Treg水平无显著差异，可能与研究对象所处病程及取材部位不同有关。由此可见，Treg细胞及相关因子在银屑病患者体内的行为还需进一步探究。

近年来，关于负性共刺激因子的表达成为研究热点。PD-1分子属CD28/细胞毒性T淋巴细胞抗原超家族，主要通过与其配体PD-L1结合传递负性协同刺激信号，抑制T淋巴细胞增殖活化，进而在外周免疫耐受建立中发挥重要作用。本研究显示，与健康人群比较，PV患者外周血PD-L1 mRNA水平下降而PD-1 mRNA水平升高，可能与PV患者PBMC中程序性细胞死亡受体1（PDCD1）基因的表达下调有关。PD-1 mRNA表达升高可能是机体对PDCD1表达量下调的负反馈调节，PDCD1的负性调控信号减弱，PD-L1 mRNA表达下降，下游信号通路的NF-κB等分子过度激活，致使单核细胞、T淋巴细胞过度活化，产生大量炎症因子。本研究结果显示，外周血Th17、PD-1 mRNA高于均值者发生PV风险增加，PD-L1 mRNA高于均值者发生PV风险降低，说明Th17、PD-L1 mRNA、PD-1 mRNA变化与PV发病关系密切。

本研究发现，随着PV病情进展，患者外周血Th17、PD-L1 mRNA水平升高，PD-1 mRNA水平降低。廖晓容等［17］发现，PV进行期患者外周血Th17细胞比例及血清IL-17水平高于静止期患者，与本研究结果相一致。此外，相关性分析显示，PV患者外周血Th17、PD-L1 mRNA水平与PASI评分呈正相关，PD-1 mRNA与PASI评分呈负相关。这说明PV患者外周血Th17、PD-L1 mRNA、PD-1 mRNA与PV病情程度有关，有望成为评估PV严重程度的可靠实验室指标。华圣元等［18］通过免疫荧光方法发现，PV患者皮损真皮上部广泛表达PD-1，皮损处70%的T淋巴细胞表达PD-1，超过95%的IL-17A+T淋巴细胞表达PD-1。但是，Th17与负性共刺激因子间是否具有相关性仍不十分明确。本研究发现，PV患者外周血Th17与PD-1 mRNA呈负相关、与PD-L1 mRNA呈正相关。其原因可能为PV患者PDCD1基因缺失后失去抑制Th17细胞产生IL-17等炎性因子的能力，致使IL-17水平升高，极大增加了对中性粒细胞的招募及炎症通路的过度激活；Th17表达所致PD-1下调，致使PD-1与PD-L1结合变少，进一步上调PDL1 mRNA表达。这提示临床可从纠正PD-L1、PD-1 mRNA表达及减少Th17方面出发，选择恰当药物治疗PV。

综上可知，PV患者外周血Th17、PD-L1 mRNA水平升高而PD-1 mRNA水平降低，且三者与PV发生及患者病情程度具有相关性；纠正PV患者Th17/Treg及负性共刺激因子表达有望成为新的药物治疗靶点，可为PV治疗提供新的方向。