长链非编码RNA LINC00665对小细胞肺癌增殖、侵袭的影响及其与miR-186-5p的调控关系

潘喜峰，马艳菊，唐域，赵舣航，于淼淼，王贺

中国医科大学肿瘤医院辽宁省肿瘤医院，沈阳 110042

肺癌包括小细胞肺癌（SCLC）与非小细胞肺癌（NSCLC），发病率与病死率较高［1］。随着表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂和免疫检查点抑制剂等药物成功用于临床，NSCLC患者的预后有了显著改善［2］，但是SCLC的相关研究较少。因此，对SCLC发生发展的分子机制进行更深入地研究与探索，寻找SCLC潜在治疗靶点，具有重要临床意义。长链非编码RNA（LncRNA）是一类长度超过200个核苷酸的非编码RNA，可通过表观遗传修饰［3］、LncRNA-miRNA相互作用［4］、LncRNA-蛋白相互作用等多种机制调控基因的表达［5］。LINC00665作为LncRNA的一员，在乳腺癌［6］、前列腺癌［7］中表达上调，能促进肿瘤细胞的增殖和侵袭转移，但是LINC00665在SCLC中的功能及作用机制尚不清楚。miR-186-5p在骨肉瘤［8］、结直肠癌［9］中表达显著下调，可通过调控下游的mRNA抑制肿瘤进展。通过StarBase数据库发现，miR-186-5p是LINC00665的潜在靶点。SHAN等［10］在肝细胞癌（HCC）中发现LINC00665可以介导miR-186-5p，从而抑制HCC细胞的凋亡和自噬。但是，二者在SCLC中是否也存在调控关系尚不明确。2019年5月—2021年1月，我们观察了LINC00665在SCLC细胞中的表达情况及其对肿瘤细胞增殖、侵袭的影响，并分析在此过程中LINC00665与miR-186-5p是否存在调控关系，为研究LINC00665在SCLC发病过程中的作用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 细胞及试剂：SCLC细胞H1688和正常肺上皮细胞BEAS-2B均购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，逆转录试剂盒购于美国Invit‐rogen公司，胎牛血清购于美国Gibco公司，RPMI-1640培养基购于美国Gibco公司，BEBM培养基购于瑞士Lonza公司，TB Green Premix Ex TaqTMⅡ及PrimeScriptTMRT Master Mix均购于日本Takara公司，LINC00665过表达片段、LINC00665阴性序列片段、miR-186-5p过表达片段均购于上海吉玛制药技术有限公司，LipofectamineTM2000转染试剂盒购于美国Invitrogen公司。实验仪器：超低温冰箱（TSE240V-ULTS，德 国Thermo），多 功 能 酶 标 仪（LABTECH PHERAstar FS，德国BMG），超微量分光光度计（DS-11FX，美国Denovix），高速冷冻离心机（5804R，德国Eppendorf），实时荧光定量PCR仪（CFX96 Touch，美国BIO-RAD）。

1.2 H1688、BEAS-2B细胞培养 将H1688、BEAS-2B细胞分别接种于RPMI-1640、BEBM培养基，置于37℃、5%CO2培养箱中。每天观察细胞生长状态，1～2 d更换一次新鲜培养基。当细胞基本铺满培养器皿生长面时，取出培养器皿，对细胞进行传代。

1.3 LINC00665在H1688、BEAS-2B细胞中的表达检测 采用实时荧光定量PCR法。取H1688、BEAS-2B细胞，通过TRIzol试剂分别提取细胞的总RNA；使用逆转录试剂盒合成cDNA，-20℃保存备用。参考人源LINC00665及U6在Gen Bank中的基因序列，选择同源性高的区域设计引物，由武汉金开瑞生物工程有限公司合成。引物序列：LINC00665上游为5′-GAGGACTCAGAGGTGGAATT-3′，下 游 为5′-GA‐CAGCCAGCTTGTAGGG-3′；U6上游为5′-GCTTCG‐GCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游为5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。按照实时荧光定量PCR试剂盒进行操作，以U6为内参，按2－ΔΔCt计算LINC00665相对表达量。

1.4 LINC00665对H1688细胞增殖、侵袭及miR-186-5p表达影响的观察。

1.4.1 细胞分组与转染 将对数生长期的H1688细胞分为三组，LINC00665过表达组和阴性序列组分别按照LipofectamineTM2000试剂盒说明书转染LINC00665过表达序列和对照序列48 h，对照组不转染。

1.4.2 细胞增殖活性观察 采用MTT法。取对数生长期的各组细胞，用0.25%胰酶消化成单细胞悬液，离心重悬后调整细胞密度为5×104/mL，以5×103/孔接种于96孔板，并设复孔，放入37℃、5%CO2培养箱中孵育。分别在0、24、48、72 h时，在不同复孔中加入MTT溶液，继续培养4 h。用酶标仪在490 nm波长处检测每孔的OD值，以此表示细胞增殖活性。

1.4.3 细胞侵袭能力观察 采用Transwell侵袭实验。取对数生长期的各组细胞，用0.25%胰酶消化成单细胞悬液，离心重悬后调整细胞密度为5×105/mL，以5×104/孔接种于上室，将含有10%FBS的培养基置于下室，上下室内培养液以聚碳酸酯膜相隔，并在上室侧铺有一层基质胶。37℃、5%CO2培养箱中孵育24 h后，将附着在下表面的穿膜细胞固定并染色；在显微镜下5个区域中计数穿膜细胞，取平均数表示细胞侵袭能力。

1.4.4 细胞中miR-186-5p表达检测 采用实时荧光定量PCR法。取对数生长期的各组细胞，操作方法同“1.3”。引物序列：miR-186-5p上游为5′-GCG‐GATCCGAGCCATGCTTATGCTACTG-3′，下游为5′-GCGCGGCCGCCCAGGTATATGGCA-3′，由武汉金开瑞生物工程有限公司合成；以U6为内参，按2－ΔΔCt计算miR-186-5p相对表达量。

1.5 LINC00665与miR-186-5p在H1688细胞增殖、侵袭中的调控关系分析

1.5.1 细胞分组与转染 将对数生长期的H1688细胞另分为三组，LINC00665过表达组和miR-186-5p+LINC00665过表达组分别按照LipofectamineTM2000试剂盒说明书转染LINC00665过表达序列、miR-186-5p+LINC00665过表达序列48 h，对照组不转染。

1.5.2 miR-186-5p对细胞中LINC00665表达影响的观察 取对数生长期的各组细胞，采用实时荧光定量PCR法检测细胞中LINC00665表达量，方法同“1.3”。

1.5.3 miR-186-5p对LINC00665过表达所致H1688细胞增殖、侵袭影响的观察 取对数生长期的各组细胞，采用MTT法观察细胞增殖情况，方法同“1.4.2”；采用Transwell侵袭实验观察细胞侵袭能力，方法同“1.4.3”。

1.6 统计学方法 采用SPSS21.0统计软件。计量资料以±s表示，两组数据比较行t检验，多组数据比较行单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 H1688、BEAS-2B细胞中LINC00665表达比较LINC00665在H1688细胞中的表达量为10.66±1.19，高于BEAS-2B细胞中的1.01±0.03（P＜0.05）。

2.2 LINC00665对H1688细胞增殖的影响LINC00665过表达组除0 h外，同时点细胞OD值高于阴性序列组和对照组（P均＜0.05），阴性序列组与对照组同时点细胞OD值差异均无统计学意义。见表1。

表1 LINC00665对H1688细胞增殖的影响（±s）

表1 LINC00665对H1688细胞增殖的影响（±s）

注：与对照组同时点比较，*P＜0.05；与阴性序列组同时点比较，#P＜0.05。

组别LINC00665过表达组阴性序列组对照组细胞OD值0 h 0.25±0.03 0.27±0.04 0.25±0.02 24 h 0.87±0.02*#0.52±0.02 0.54±0.03 48 h 1.26±0.03*#0.84±0.04 0.83±0.05 72 h 1.74±0.05*#1.11±0.08 1.17±0.07

2.3 LINC00665对H1688细胞侵袭的影响 LINC00665过表达组、阴性序列组、对照组穿膜细胞数分别为（139.33±3.06）、（25.67±2.08）、（26.33±2.31）个，LINC00665过表达组穿膜细胞数多于阴性序列组和对照组（P均＜0.05），阴性序列组与对照组穿膜细胞数差异无统计学意义。见图1。

图1 LINC00665对H1688细胞侵袭的影响（Transwell侵袭实验）

2.4 LINC00665对H1688细胞中miR-186-5p表达的影响 LINC00665过表达组、阴性序列组、对照组细胞中miR-186-5p表达量分别为0.54±0.03、1.02±0.02、1.05±0.04，LINC00665过表达组细胞中miR-186-5p表达量低于阴性序列组和对照组（P均＜0.05），阴性序列组与对照组细胞中miR-186-5p表达量差异无统计学意义。

2.5 LINC00665与miR-186-5p在H1688细胞增殖、侵袭中的调控关系

2.5.1 miR-186-5p对细胞中LINC00665表达的影响 细胞中LINC00665表达量，LINC00665过表达组（1.95±0.09）＞miR-186-5p+LINC00665过表达组（1.46±0.08）＞对照组（0.99±0.04），P均＜0.05。

2.5.2 miR-186-5p对LINC00665过表达所致细胞增殖的影响 除0 h外同时点细胞OD值，LINC00665过表达组＞miR-186-5p+LINC00665过表达组＞对照组，P均＜0.05。见表2。

表2 miR-186-5p对LINC00665过表达所致H1688细胞增殖的影响（±s）

表2 miR-186-5p对LINC00665过表达所致H1688细胞增殖的影响（±s）

注：与对照组同时点比较，*P＜0.05；与miR-186-5p+LINC00665过表达组同时点比较，#P＜0.05。

组别miR-186-5p+LINC00665过表达组LINC00665过表达组对照组细胞OD值0 h 0.22±0.02 0.24±0.03 0.21±0.03 24 h 0.59±0.05 0.85±0.06*#0.55±0.05 48 h 0.94±0.06 1.29±0.07*#0.86±0.05 72 h 1.37±0.08 1.77±0.09*#1.16±0.07

2.5.3 miR-186-5p对LINC00665过表达所致细胞侵袭的影响 LINC00665过表达组、miR-186-5p+LINC00665过表达组、对照组穿膜细胞数分别为（141.67±4.51）、（75.33±3.21）、（27.33±1.53）个，穿膜细胞数LINC00665过表达组＞miR-186-5p+LINC00665过表达组＞对照组（P均＜0.05）。见图2。

图2 miR-186-5p对LINC00665过表达所致H1688细胞侵袭的影响（Transwell侵袭实验）

3 讨论

越来越多的研究发现，LncRNA在调控基因组活性的多个方面发挥至关重要的作用［11］，包括转录调控、RNA剪接、蛋白质翻译后修饰等［12］。LncRNA可以通过对组蛋白进行修饰和染色体重构等方式参与染色体结构调控［13］，通过修饰编码蛋白基因的启动子或介导启动子的去甲基化等途径参与转录调节［14］，还可通过影响蛋白质的磷酸化或泛素化参与蛋白质活性调控等［15］。LncRNA与机体的发育和疾病密切相关，在肿瘤的发病中也具有重要作用。

LINC00665作为LncRNA的一员，在多种肿瘤的发生发展中起促进作用。研究表明，LINC00665在结直肠癌组织中表达上调，可通过调节miR-9-5p/ATF1轴促进结直肠癌细胞的增殖和侵袭，并抑制细胞凋亡［16］。在卵巢癌组织中，LINC00665表达上调与患者预后不良有关；LINC00665可通过竞争性结合miR-34a-5p减弱其对下游基因E2F3的抑制作用，从而促进卵巢癌的进展［17］。本实验结果发现，LINC00665在SCLC细胞中表达上调，而且LINC00665过表达可促进SCLC细胞的增殖和侵袭。这提示LINC00665在SCLC中起促癌作用，但具体作用机制尚不清楚。

miRNA在基因表达调控方面起重要作用。其异常表达可以引起多种疾病，包括肿瘤、心血管疾病及神经系统疾病等。miR-186-5p作为一种miRNA，在神经母细胞瘤（NB）中可靶向作用于Eg5的3"端非翻译区降低Eg5表达，从而抑制NB细胞增殖［18］。在胃癌组织和细胞中miR-186-5p低表达，并可通过调控NEK2抑制细胞周期并促进细胞凋亡［19］。研究表明，miR-186-5p过表达可抑制HCC细胞增殖，诱导细胞凋亡和自噬；进一步研究发现，miR-186-5p表达与HCC细胞中的LINC00665或MAP4K3（具有与miR-186-5p的结合位点）呈负相关，即LINC00665通过miR-186-5p/MAP4K3轴抑制了HCC细胞的凋亡和自噬［10］。本实验结果显示，LINC00665过表达时，可降低SCLC中miR-186-5p表达，而miR-186-5p过表达则减弱LINC00665对SCLC细胞增殖和侵袭的促进作用，即LINC00665可促进SCLC细胞增殖、侵袭，该作用与其调控miR-186-5p表达有关。

综上所述，本研究发现LINC00665在SCLC细胞中表达上调，并可通过负向调控miR-186-5p促进SCLC细胞的增殖和侵袭。这将为临床上寻找SCLC潜在的治疗靶点提供一定的参考依据，有利于提高SCLC患者的治疗效果。但是本研究仅分析了二者在H1688细胞中的作用，后续将在肿瘤及癌旁组织进行相关实验，以验证本研究结果的准确性。