和厚朴酚对重度烧伤大鼠早期心肌损伤的保护作用及其机制

纪兆乐,秦超师,王芳芳,白宝宝,刘鹏云,周海佳

(空军军医大学唐都医院心血管内科,西安 710038;*通讯作者,E-mail:haijiazhouafmu@126.com)

临床研究发现,在重度烧伤的初始阶段即可出现心肌损伤。如果没有立即进行医疗干预,其损伤将严重影响心脏功能,并可能进一步诱发或加重烧伤休克,从而导致患者机体循环功能障碍甚至死亡[1,2]。因此,寻找预防重度烧伤心肌并发症的有效治疗措施已成为当前临床工作的重点。尽管重度烧伤引起的心肌损伤的确切机制还没有完全阐明,但越来越多的证据表明,心肌损伤的发生涉及多个病理生理过程,包括缺氧、炎症、钙信号传导、细胞凋亡、败血症和氧化应激等[3-5]。

和厚朴酚(honokiol, HKL)是从中药厚朴中提取的天然酚类活性物质,具有抗血管生成、抗肿瘤、抗菌、抗氧化及抗炎等多重药理学特性[6]。以往研究表明,和厚朴酚在糖尿病心肌缺血再灌注损伤[7]、脓毒症及多柔比星心肌损伤[8,9]、病理性心肌肥厚[10]等多种心血管疾病中均表现出了积极的作用,但HKL对重度烧伤所致心肌损伤的影响尚无相关报道。因此,本研究旨在探讨HKL对重度烧伤早期心肌损伤的保护作用及其机制是否与减轻氧化应激损伤和炎症反应有关。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 主要试剂 和厚朴酚(HKL)(Sigma公司,美国);肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α),白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)和血管细胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)ELISA试剂盒(USCN life公司,美国);TUNEL凋亡检测试剂盒(Roche公司,瑞士);二氢乙锭(dihydroethidium,DHE)活性氧检测试剂盒(Invitrogen公司,美国);超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所,中国);抗Nrf2、cleaved Caspase-3抗体(Abcam公司,美国);抗β-actin抗体(北京中杉公司,中国)。

1.1.2 实验动物 8周龄SPF级雄性SD大鼠40只,体质量200-250 g购自空军军医大学动物实验中心,动物生产许可证号:SCXK(军)2007-007号。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型建立 采用背部烫伤法来构建大鼠重度烧伤模型[11],具体操作流程如下:用戊巴比妥钠腹腔注射(50 mg/kg)麻醉大鼠后,将大鼠背部剃毛(剃除部分占大鼠30%全身表面积)并将剃毛部位置于100 ℃热水中浸泡12 s,形成30%全身表面积全层真皮烧伤模型。烧伤后0,6 h分别向腹腔注射乳酸林格液(50 mg/kg)进行液体复苏。所有大鼠处理后均单笼饲养,烧伤后每隔12 h皮下注射丁丙诺啡(0.25 mg/kg)镇痛。假烧伤组大鼠除将背部剃毛部位浸入37 ℃温水中浸泡12 s外,其他处理均与烧伤组相同。

1.2.2 动物分组及处理 将SD大鼠随机分为4组:假烧伤组(sham)、假烧伤+和厚朴酚处理组(sham+HKL)、烧伤组(burn)、烧伤+和厚朴酚处理组(burn+HKL),每组10只。burn组和burn+HKL组大鼠给予重度烧伤操作,sham组和sham+HKL组大鼠给予假烧伤操作。sham+HKL组和burn+HKL组大鼠分别在背部浸泡后0,6,12 h向腹腔注射5 mg/kg的HKL药物,sham组和burn组大鼠则在相同时间点给予腹腔注射相同体积的生理盐水。

1.2.3 心脏功能监测 大鼠左胸前区脱毛,经异氟烷吸入麻醉后,仰卧位固定在操作平台上,用Vevo 770(VisualSonics公司,加拿大)小动物超声仪测定大鼠超声心动图,记录左室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)和左室短轴缩短率(left ventricular fractional shortening,LVFS)以评价大鼠心脏收缩功能,通过舒张期胸骨旁短轴视图测量二尖瓣E/A比值(E/A ratio)以评价大鼠心脏舒张功能。

1.2.4 心肌组织染色 ①HE染色:将大鼠心脏标本制备成5 μm厚的石蜡切片后脱蜡至水,用苏木素染细胞核,伊红染细胞质,再脱水封片,显微镜观察并拍照。②TUNEL染色:按照TUNEL试剂盒说明书对制备好的心脏石蜡切片进行染色,用激光共聚焦显微镜对染色好的切片观察并拍照。每张切片随机选取5个高倍视野进行盲法观察。DAPI染色阳性(蓝色)计数为一个细胞,与之重叠的绿色点则视为凋亡细胞,凋亡指数以凋亡细胞占总细胞数的百分比来确定。③DHE染色:按照DHE试剂盒说明书对制备好的5 μm厚的心脏冰冻切片进行染色,用激光共聚焦显微镜对染色好的切片观察并拍照。每张切片随机选取5个高倍视野进行盲法观察。使用Image-Pro Plus软件分析切片中的乙锭荧光强度代表各组心肌组织(reactive oxygen species, ROS)生成量。

1.2.5 心肌损伤标志物测定 经大鼠颈总动脉取血并收集至离心管中,待放置于室温自然凝血后,3 000 r/min离心15 min收集上层血清,用血生化分析仪测定心肌损伤标志物LDH和CK-MB的含量。

1.2.6 心肌炎症水平测定 如1.2.5方法获取大鼠血清标本,按照ELISA试剂盒说明书设定反应条件,待反应终止后用酶标仪测定吸光密度值并分别计算各组大鼠血清中炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α,黏附分子ICAM-1和VCAM-1的水平。

1.2.7 心肌SOD活性及MDA含量测定 剪取大鼠左心室部分心肌组织,用生理盐水制备成组织匀浆。严格按照试剂盒说明书检测SOD活性及MDA水平。

1.2.8 Western blot检测蛋白表达 心肌组织蛋白标品按每孔40 μg进行上样,采用SDS-PAGE分离胶进行蛋白电泳并通过湿转法转移至PVDF膜上。室温下封闭2 h后,将条带孵育在Nrf2(1 ∶1 000)、cleaved Caspase-3(1 ∶1 000)和β-actin(1 ∶5 000)的抗体管中,4 ℃过夜。TBST液洗涤3次,再使用辣根过氧化物酶标记的二抗(1 ∶4 000)室温孵育2 h。用ECL化学发光液显影,通过凝胶成像系统检测各蛋白表达水平。

1.3 统计学分析

用Prism 5.0软件进行统计分析,以均数±标准差表示实验数据,采用单因素方差分析和LSD-t检验比较组间差异。P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 和厚朴酚改善重度烧伤大鼠心脏舒缩功能障碍

超声心动图检测心脏功能结果显示,与sham组相比,burn组大鼠心脏舒缩功能均显著受损,表现为LVEF、LVFS值与E/A值均显著降低(P<0.01),且E/A值<1;给予和厚朴酚处理后,与burn组相比,burn+HKL组大鼠LVEF、LVFS值与E/A值显著升高(P<0.05),且E/A值>1。与sham组相比,sham+HKL组LVEF、LVFS和E/A值均无明显差异(P>0.05,见图1)。可见,和厚朴酚处理可显著改善重度烧伤大鼠心脏舒缩功能障碍。

与sham组相比,*P<0.05,**P<0.01;与burn组相比,#P<0.05,##P<0.01图1 和厚朴酚对重度烧伤大鼠心脏功能的影响Figure 1 The effects of honokiol on the cardiac function in severely burned rats

2.2 和厚朴酚减轻重度烧伤大鼠心肌组织损伤

心肌组织HE染色结果显示,与sham组相比,burn组大鼠心肌细胞水肿,横纹模糊,部分灶性溶解,心肌纤维出现波浪状改变,肌束分离;给予和厚朴酚处理后,与burn组相比,burn+HKL组大鼠心肌组织病变程度得到显著改善,心肌细胞溶解坏死明显减轻。与sham组相比,sham+HKL组在心肌微观组织结构改变上无明显差异(见图2)。心肌组织损伤标志物检测结果显示,与sham组相比,burn组大鼠LDH和CK-MB均显著升高(P<0.01);给予和厚朴酚处理后,与burn组相比,burn+HKL组大鼠的LDH和CK-MB值显著降低(P<0.01)。与sham组相比,sham+HKL组血清LDH和CK-MB无明显差异(P>0.05,见图2)。可见,和厚朴酚处理可显著减轻重度烧伤大鼠心肌组织损伤。

与sham组相比,**P<0.01;与burn组相比,##P<0.01图2 和厚朴酚对重度烧伤大鼠心肌组织结构及血清LDH和CK-MB水平的影响Figure 2 The effects of honokiol on the structure of myocardial tissue and serum LDH and CK-MB levels in severely burned rats

2.3 和厚朴酚抑制重度烧伤大鼠心肌细胞凋亡

心肌组织TUNEL染色检测细胞凋亡结果显示,与sham组相比,burn组大鼠心肌细胞凋亡率明显上升(P<0.01);给予和厚朴酚处理后,与burn组相比,burn+HKL组大鼠心肌细胞凋亡率明显下降(P<0.01，见图3)。

与sham组相比,**P<0.01;与burn组相比,##P<0.01图3 和厚朴酚对重度烧伤大鼠心肌细胞凋亡水平的影响Figure 3 The effects of honokiol on cardiomyocyte apoptosis in severely burned rats

此外,凋亡蛋白cleaved Caspase-3表达结果显示,与sham组相比,burn组大鼠心肌组织cleaved Caspase-3蛋白表达明显上升(P<0.01);给予和厚朴酚处理后,与burn组相比,burn+HKL组大鼠心肌组织cleaved Caspase-3蛋白表达被显著抑制(P<0.01)。与sham组相比,sham+HKL组心肌细胞凋亡率及cleaved Caspase-3的蛋白表达均无明显差异(P>0.05,见图3)。可见,和厚朴酚处理可显著抑制重度烧伤大鼠心肌细胞凋亡。

2.4 和厚朴酚抑制重度烧伤大鼠心肌炎症反应

血清炎症因子及黏附分子检测结果显示,与sham组相比,burn组大鼠血清中炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α及黏附分子ICAM-1和VCAM-1的含量均显著增加(P<0.01);给予和厚朴酚处理后,与burn组相比,burn+HKL组大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α及ICAM-1和VCAM-1的水平均显著降低(P<0.05)。与sham组相比,sham+HKL组上述血清炎症因子及黏附分子的表达无明显差异(P>0.05,见图4)。可见,和厚朴酚处理可显著抑制重度烧伤大鼠心肌组织炎症反应。

与sham组相比,*P<0.05,**P<0.01;与burn组相比,#P<0.05,##P<0.01图4 和厚朴酚对重度烧伤大鼠血清炎症因子及黏附分子水平的影响Figure 4 The effects of honokiol on the serum levels of inflammatory cytokines and adhesion molecules in severely burned rats

2.5 和厚朴酚减轻重度烧伤大鼠心肌组织氧化应激损伤

心肌组织SOD活性及MDA含量检测结果显示,与sham组相比,burn组大鼠心肌组织中MDA含量显著增加,SOD活性显著下降(P<0.01);给予和厚朴酚处理后,与burn组相比,burn+HKL组大鼠心肌组织中MDA含量明显降低,SOD活性明显升高(P<0.01)。此外,心肌组织ROS生成量及抗氧化蛋白Nrf2表达结果显示,与sham组相比,burn组大鼠心肌组织ROS产量显著增加,Nrf2蛋白表达量明显下降(P<0.01);给予和厚朴酚处理后,与burn组相比,burn+HKL组大鼠心肌组织ROS生成量明显下降,Nrf2蛋白表达量明显上调(P<0.01)。与sham组相比,sham+HKL组上述氧化应激指标均无明显差异(P>0.05,图5)。可见,和厚朴酚处理可显著减轻重度烧伤大鼠心肌组织氧化应激损伤。

与sham组相比,*P<0.05,**P<0.01;与burn组相比,#P<0.05,##P<0.01图5 和厚朴酚对重度烧伤大鼠心肌组织氧化应激水平的影响Figure 5 The effects of honokiol on myocardial oxidative stress level in severely burned rats

3 讨论

临床证据显示,重度烧伤早期阶段心肌能量代谢障碍即已发生。由于心脏的特殊重要性,重度烧伤引起的心肌损伤将进一步加重其他组织和器官的缺血性和缺氧性损害,成为导致重度烧伤患者病死率增加的重要因素之一,尤其是在已患有相关心脏疾病的个体中[12,13]。因此,烧伤后给予有效的心肌保护,对改善机体心功能不全,减轻其他组织器官并发损伤和促进患者预后,均具有重要意义。

和厚朴酚是一种含有烯丙基的连苯二酚类化合物,具有多重药理学作用,是中药厚朴最主要的两个活性组分之一,被应用于治疗多种消化道疾病[14]。值得注意的是,和厚朴酚的心肌保护效应在近年来受到越来越广泛的关注。张彬等[7]研究发现,和厚朴酚可通过激活SIRT1/Nrf2信号通路减轻I型糖尿病小鼠心肌缺血再灌注损伤。翟蒙恩等[8]观察到和厚朴酚可通过抑制脓毒症诱发的心肌氧化应激和凋亡,最终减轻脓毒症心肌损伤。此外,和厚朴酚还可通过激活线粒体SIRT3信号减轻多柔比星诱发的小鼠心肌损害[9],以及阻断和逆转小鼠心肌肥厚[10]。然而和厚朴酚能否缓解重度烧伤引起的心肌损伤尚未见报道。本研究发现,burn组大鼠心脏超声LVEF、LVFS与E/A值较sham组均显著降低,HE染色见心肌纤维排列紊乱且心肌细胞溶解明显,心肌组织损伤标志物LDH和CK-MB活性显著上升。而和厚朴酚处理可明显提高重度烧伤大鼠的LVEF、LVFS和E/A值,改善心肌组织微观结构病理性改变,降低心肌损伤标志物的活性,本研究首次证实了和厚朴酚处理可显著改善重度烧伤大鼠心脏舒缩功能障碍及心肌组织损伤。

心肌细胞凋亡通常发生在重度烧伤后数小时内,细胞凋亡率的增加会严重影响心脏功能[15,16]。抑制心肌细胞凋亡已成为缓解重度烧伤所致心肌损伤的重要一环。Liu等[17]报道,葛根素可通过激活Akt同时抑制p38-MAPK信号抑制心肌细胞凋亡,改善重度烧伤大鼠心功能不全。王长鹰等[18]发现,金丝桃苷可通过激活SIRT1信号通路抑制心肌细胞凋亡,减轻重度烧伤大鼠心肌损伤。本研究结果同样发现,与sham组相比,burn组大鼠心肌细胞凋亡率及凋亡蛋白cleaved Caspase-3的表达均明显上升。给予和厚朴酚处理后可以显著降低重度烧伤大鼠心肌细胞凋亡率及凋亡蛋白的表达,进一步证实了和厚朴酚抗重度烧伤所致心肌损害的作用。

近年来研究表明,重度烧伤心肌损害程度与心肌组织炎症反应强度密切相关[2,19]。其中,炎症因子与黏附分子在炎症反应中扮演着重要角色。肿瘤坏死因子(TNF-α)和白细胞介素(IL-1β、IL-6)是引起心肌损伤最重要的炎症因子。一方面,过量炎症因子之间相互作用产生网络效应,趋化中性粒细胞进入组织器官。另一方面,大量的中性粒细胞又能释放过量的炎症因子,形成恶性循环,从而加重了炎症反应[20]。而血管细胞黏附分子(VCAM-1)和细胞间黏附分子(ICAM-1)则参与了中性粒细胞黏附心肌细胞并释放细胞毒素损伤细胞功能的过程,成为引起心肌组织损伤的病理基础之一[21]。因此,抑制炎症因子和黏附分子的激活在减轻重度烧伤所致的心肌损伤防治中具有重要价值。本研究结果发现,与sham组相比,burn组大鼠血清中炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α及黏附分子ICAM-1和VCAM-1的含量均显著增加。给予和厚朴酚处理后可以显著降低重度烧伤大鼠心肌上述炎症因子及黏附分子的表达。以上结果提示和厚朴酚可通过抑制心肌炎症反应从而发挥抗重度烧伤所致心肌损害的作用。

大量证据表明,氧化应激在烧伤引起的心肌损伤中也起着关键作用[2,22]。氧化应激是ROS产生和消除之间不平衡发展的结果。在正常情况下,机体具有有效的抗氧化防御系统,可以对抗过多的ROS的生成。而在重度烧伤等病理情况下,心肌细胞会出现能量代谢障碍,其抗氧化防御能力遭到破坏,继而生成了过量的ROS,加重了心肌组织氧化应激反应,从而导致心脏结构和功能损伤[23]。此外,MDA作为不饱和脂肪酸过氧化的一种末端代谢产物,被认为是反映氧自由基水平的重要指标。SOD可参与维持细胞氧化还原的平衡,还可以清除氧化应激产生的氧自由基,作为一种重要的抗氧化剂和细胞保护剂。因此,通过检测MDA和SOD可以间接地反映氧化应激损伤程度[24]。本研究结果发现,与sham组相比,burn组大鼠心肌组织ROS产量显著增加,抗氧化蛋白Nrf2表达量明显下降,且心肌组织中MDA含量显著增加,SOD活性显著下降。和厚朴酚处理可以显著减少重度烧伤大鼠心肌组织ROS产量,增加Nrf2的蛋白表达,降低MDA含量及提高SOD活性。以上结果提示和厚朴酚可通过抑制心肌氧化应激反应从而发挥抗重度烧伤所致心肌损害的作用。

氧化应激损伤和炎症反应均可通过介导心肌细胞凋亡导致心肌损伤。过度增加的ROS可通过刺激脂质过氧化来损伤膜的屏障作用,使膜流动性降低,钙离子通透性增加,加重细胞内钙超载和线粒体损伤,诱发细胞色素C等促凋亡因子的释放[25]。而机体在病理状态下产生的大量炎症因子可以募集不同类型的免疫细胞浸润,影响了心肌局部的免疫微环境。免疫细胞分泌的炎症介质(基肽、一氧化氮等)同样也可以破坏膜完整性和酶功能,导致线粒体功能损害及凋亡机制的激活[26]。与此同时,氧化应激和炎症是紧密相连的。一方面,炎症因子(如IL-6、TNF-α)可以刺激中性粒细胞产生大量氧自由基;另一方面,氧化应激损伤的脂质过氧化终产物又可以诱导单核-巨噬细胞表达黏附分子、细胞因子、促炎因子及其他炎症反应的中介物[27]。此外,当大量病理性凋亡出现时,超过邻近细胞和局部单核巨噬细胞的清除水平,未能被吞噬的凋亡心肌细胞将发生继发性坏死、崩解,并释放大量氧化应激与炎性介质,形成损伤与凋亡之间的恶性循环[28]。

综上所述,和厚朴酚处理可明显减轻重度烧伤大鼠早期心肌损伤,其机制可能与抑制心肌组织氧化应激与炎症反应有关。