连翘归尾煎对人乳腺癌MCF-7细胞增殖、迁移、凋亡和周期的影响

遆安航,陈 瑾,翟康欣,李思思,谭丽媛,张淑蓉

(山西中医药大学基础化学实验室,晋中 030600;*通讯作者,E-mail:zhangsr62@163.com)

连翘归尾煎由连翘、当归尾、甘草、大血藤、金银花组成,始载于《景岳全书》,具清热解毒、活血消肿之功,主治阳分痈毒,或在脏腑、肺膈、胸乳之间者[1]。《古今图书集成医部全录》记载:“若郁热在经,而为瘫疽为疮疹者,宜连翘归尾煎[2]”。现代文献见有连翘归尾煎治疗乳痈、口疽、颊疡、牙痈、猪丹毒等的报道[3]。文献资料显示方中各单味药及有效成分均具有抗肿瘤作用,连翘不同浓度的乙醇提取物对人胃癌、肝癌、食管癌、前列腺癌细胞等都有不同程度的体内外抑制作用[4,5];当归多糖、挥发油等主要活性成分能明显抑制人乳腺癌、肝癌、肺癌细胞[6,7];大血藤次生代谢产物、缩合鞣质等成分对乳腺癌细胞有明显的抑制作用[8,9];金银花及其有效成分绿原酸、多糖等可以诱导癌细胞分化,抑制肿瘤生长[10-12];甘草中的异甘草素、甘草次酸可以显著抑制乳腺癌、宫颈癌、肺癌及胰腺癌等癌细胞的生长,光甘草素、甘草查耳酮A等也具有抗肿瘤作用[13,14]。本实验探讨了连翘归尾煎20%乙醇提取物对人乳腺癌MCF-7细胞的抑制作用以及对细胞凋亡、迁移和周期的影响,为其进一步开发研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 细胞与药物

人乳腺癌MCF-7细胞株(CX0200购自山西博士德公司)。连翘2019年7月采于山西太原,蒸制烘干;金银花(批号1909011)、甘草(批号1909039)、大血藤(批号1909013)均购于山西万民药房;归尾(批号1909032)购于北京同仁堂,经山西中医药大学中药学院裴香萍副教授鉴定以上品种均为《中国药典》(2020版)收载品种。

1.2 仪器与试剂

流式细胞仪:美国BD公司(facxcalibur);超净工作台:新加坡Esco公司(OPTI MAIR);酶标仪:上海美谷分子仪器有限公司(Spectramax);CO2培养箱:上海聚莱实验仪器有限公司(ENCO2-1246);倒置显微镜:北京长恒荣创科技有限公司(Nikon-ECLIPSE-TS100);立式灭菌器:上海博讯医疗生物仪器股份有限公司(YXQ-LS-100A)。

磷酸盐缓冲液(无菌PBS、批号:PYG0021)、MEM(批号:09I01A29)、CCK-8试剂盒(批号:11K01A60)胰蛋白酶均购自山西博士德公司,胎牛血清(批号:20190824)购自北京赛澳美细胞技术有限公司,FITC偶联Annexin Ⅴ凋亡试剂盒(批号8128539)购自美国BD公司,盐酸阿霉素(批号313A0219)购自北京索莱宝科技有限公司。

1.3 供试品的制备

连翘归尾煎(LQGWJ)药液:按照连翘归尾煎原方称取连翘48 g、金银花30 g、大血藤30 g、归尾18 g、甘草6 g,分别加入10倍量、8倍量的20%乙醇回流提取两次,各3 h,采用旋转蒸发仪将两次提取液浓缩到500 ml后,于60 ℃烘干。实验前用L-15培养液将其配成1 mg/ml的药液,放入4 ℃冰箱保存。

盐酸阿霉素药液:精密称取盐酸阿霉素0.1 g,加入1 000 ml蒸馏水,震摇充分溶解,使其浓度为0.10 mg/ml,实验时用对应的完全培养液稀释至所需浓度。

1.4 人乳腺癌MCF-7细胞培养

将人乳腺癌MCF-7细胞株从液氮容器取出,在37 ℃的温水中轻摇使其融化;待细胞复苏完全后,置于含有10%胎牛血清和1%青链霉素的L-15培养液中[15],吹散细胞,使其成为悬液,1 000 r/min离心5 min,弃上清,补足新的培养液,在标准条件下传代培养。

1.5 CCK-8法检测细胞增殖抑制率

将生长适宜的人乳腺癌MCF-7细胞培养盒放置在超净工作台,加入胰蛋白酶消化2 min,终止消化后进行离心,弃上清加L-15培养液,吹散细胞,在96孔板中接种细胞(100 μl/孔),每孔细胞约4 500个在标准条件下培养。将培养好的人乳腺癌MCF-7细胞分别标记为无细胞空白组、阴性对照组、0.01 mg/ml盐酸阿霉素的阳性对照组以及0.1,0.3,0.5 mg/ml连翘归尾煎药物的待测样品组,继续培养24 h后,每孔加入10 μl的CCK-8溶液,在450 nm处测定吸光度,随后培养48,72 h,按上述实验方法操作。按下式计算抑制率:

细胞生长抑制率(%)=[1-(实验组OD值-空白对照组OD值)]/(对照组OD值-空白组OD值)×100%

1.6 细胞划痕法检测细胞迁移能力

预先用记号笔在6孔板背后均匀划一条横线,每孔接种MCF-7细胞大约5 000个,待细胞接种培养完全后(细胞贴壁程度符合实验需求),用移液枪头与底面横线保持垂直进行划痕;用PBS清洗并添加血清,将培养好的人乳腺癌MCF-7细胞分别标记为阴性对照组,0.01 mg/ml盐酸阿霉素的阳性对照组,0.1,0.3,0.5 mg/ml连翘归尾煎药物的待测样品组,放入标准条件培养,按照0,6,12,24 h拍照。实验每组设置3个复孔,按下式计算迁移率:

迁移率=(T0时划痕宽度值-Tt时划痕宽度值)/T0时划痕宽度值×100%

1.7 流式细胞术检测细胞凋亡率

将培养好的人乳腺癌MCF-7细胞分别标记为阴性对照组,0.01 mg/ml盐酸阿霉素的阳性对照组,0.3,0.5,0.7 mg/ml连翘归尾煎药物的待测样品组,继续在标准条件下培养12,24,48 h,收集细胞悬液,控制恒温4 ℃,此条件下添加适量PI染液和Annexin Ⅴ试剂,避光孵育20 min后,使用流式缓冲液洗涤后,通过BD Facxcalibur流式细胞仪检测凋亡率。

1.8 PI避光染色检测细胞周期的变化

实验取流式管,将培养好的人乳腺癌MCF-7细胞分别标记为阴性对照组,0.01 mg/ml盐酸阿霉素的阳性对照组,0.3,0.5,0.7 mg/ml连翘归尾煎药物的待测样品组,继续在标准条件下培养24,48,72 h,收集细胞悬液,加入1.2 ml的乙醇(浓度70%)固定细胞2 h;离心收集固定的细胞,用PBS液清洗;控制恒温4 ℃,此条件下将细胞沉淀加50 μl的RNA裂解液和200 μl的PI避光染色20 min,采用流式细胞仪检测。

1.9 统计学方法

采用SPSS22.0软件对实验数据进行统计分析,实验组与阴性对照组比较采用独立样本t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CCK-8法检测细胞抑制率

由表1可知,不同浓度的连翘归尾煎(LQGWJ)20%乙醇提取物,均能抑制人乳腺癌MCF-7细胞的增殖。在LQGWJ浓度为0.5 mg/ml,并且作用72 h时,对MCF-7细胞抑制作用最强,为46.73%。与阴性对照组比较,LQGWJ低、中、高剂量组对MCF-7细胞抑制率显著升高,差异有统计学意义(P<0.01)。

表1 连翘归尾煎对人乳腺癌MCF-7细胞抑制率的影响

2.2 细胞划痕法检测细胞迁移能力

由表2可知,在细胞迁移实验中连翘归尾煎(LQGWJ)的阴性对照组中,人乳腺癌MCF-7细胞的迁移率最高。而加入LQGWJ后,随着浓度增大,人乳腺癌MCF-7细胞迁移能力降低,说明LQGWJ 20%乙醇提取物可以抑制细胞迁移,当药物浓度为0.5 mg/ml时,迁移率最低,为(1.65±0.09)%。与阴性对照组比较,LQGWJ低、中、高剂量组的MCF-7细胞迁移率显著降低,差异有统计学意义(P<0.01)。

表2 连翘归尾煎对人乳腺癌MCF-7细胞迁移率的影响

2.3 流式细胞术检测细胞凋亡率

由图1可知,当药物作用12 h,连翘归尾煎(LQGWJ)低、中、高剂量组早凋细胞比例大于晚凋细胞比例,盐酸阿霉素组晚凋细胞比例大于早凋细胞比例,且均具有坏死细胞。随着药物作用时间延长,LQGWJ各剂量组早凋细胞比例降低,晚凋细胞比例增大,且活细胞比例降低,盐酸阿霉素组在作用细胞48 h后,坏死细胞和晚凋细胞所占比例最大(见图2,3)。同时发现当药物作用48 h时,各实验组的细胞凋亡率最大,盐酸阿霉素组细胞凋亡率为65.31%,LQGWJ低、中、高剂量组的细胞凋亡率分别为29.31%,36.52%和42.73%。与阴性对照组比较,LQGWJ 低、中、高剂量组中MCF-7细胞凋亡率显著升高,差异有统计学意义(P<0.01)。

与阴性对照组比较,**P<0.01图1 连翘归尾煎作用12 h对人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的影响Figure 1 Effect of Lianqiao Guiwei decoction for 12 h on cell apoptosis of human breast cancer MCF-7 cells

与阴性对照组比较,**P<0.01图2 连翘归尾煎作用24 h对人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的影响Figure 2 Effect of Lianqiao Guiwei decoction for 24 h on cell apoptosis of human breast cancer MCF-7 cells

与阴性对照组比较,**P<0.01图3 连翘归尾煎作用48 h对人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的影响Figure 3 Effect of Lianqiao Guiwei decoction for 48 h on cell apoptosis of human breast cancer MCF-7 cells

2.4 PI避光染色检测细胞周期的变化

当药物作用24 h,LQGWJ低、中、高剂量组G0/G1期细胞比例均大于盐酸阿霉素组,S期和G2/M期细胞比例均小于盐酸阿霉素组(见图4)。与阴性对照组比较,LQGWJ低、中、高剂量组G0/G1期细胞比例明显升高(P<0.05),LQGWJ低、中剂量组G2/M期细胞比例无明显差异,LQGWJ高剂量组G2/M期细胞比例明显升高(P<0.05,见图4)。

与阴性对照组比较,*P<0.05图4 连翘归尾煎作用24 h对人乳腺癌MCF-7细胞周期的影响Figure 4 Effect of Lianqiao Guiwei decoction for 24 h on cell cycle of human breast cancer MCF-7 cells

当药物作用48 h和72 h,LQGWJ低、中、高剂量组G0/G1期和S期细胞比例均大于盐酸阿霉素组,G2/M期细胞比例均小于盐酸阿霉素组(见图5,6)。与阴性对照组比较,LQGWJ低、中、高剂量组G0/G1期细胞比例明显升高,G2/M期细胞比例明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。

与阴性对照组比较,*P<0.05图5 连翘归尾煎作用48 h对人乳腺癌MCF-7细胞周期的影响Figure 5 Effect of Lianqiao Guiwei decoction for 48 h on cell cycle of human breast cancer MCF-7 cells

与阴性对照组比较,*P<0.05图6 连翘归尾煎作用72 h对人乳腺癌MCF-7细胞周期的影响Figure 6 Effect of Lianqiao Guiwei decoction for 72 h on cell cycle of human breast cancer MCF-7 cells

3 讨论

根据《景岳全书》的记述:“连翘归尾煎用好酒二碗,煎至一碗服”,课题组前期[16]通过CCK-8法实验和HPLC法测定,以细胞抑制率和有效成分转移率为指标,对乙醇浓度进行了考察。结果显示以20%乙醇提取物对人乳腺癌MCF-7细胞抑制作用最强,有效成分转移率最高,此点与古代米酒、果酒的浓度契合。

本实验研究了连翘归尾煎20%乙醇提取物对人乳腺癌MCF-7细胞抑制作用及对细胞凋亡和周期影响。在细胞增殖实验中,通过CCK-8法证明连翘归尾煎对人乳腺癌MCF-7细胞具有显著的抑制作用,并且抑制作用与药物浓度和作用时间呈正相关现象,实验表明当药物浓度0.5 mg/ml,作用时间72 h时,细胞抑制率达到46.73%。细胞划痕法证明连翘归尾煎20%乙醇提取物可以显著抑制细胞迁移,通过不同浓度的药物试验,发现随着给药浓度增大,抑制作用增强,细胞迁移率降低。

在细胞凋亡和细胞周期实验中,通过Annexin Ⅴ/PI双染色法实验证明,盐酸阿霉素通过增大G0/G1期和G2/M期细胞所占的比例,降低S期细胞的比例,从而抑制MCF-7细胞的增殖。而连翘归尾煎通过增大G0/G1期细胞所占比例,降低S期和G2/M期细胞的比例,从而抑制MCF-7细胞的增殖,同时发现连翘归尾煎随着浓度增大,作用时间延长,细胞的凋亡率增大,将连翘归尾煎提取物配成0.7 mg/ml的药液,给药48 h,细胞凋亡率为42.73%,此时药效最佳。

综上所述,连翘归尾煎20%乙醇提取物可以明显抑制人乳腺癌MCF-7细胞的增值,同时抑制细胞迁移,通过调控细胞周期,延长DNA复制时间,促进人乳腺癌MCF-7细胞的凋亡。