山羊痘病毒毒力因子KLP1互作蛋白的筛选与初步鉴定

高 娜，童剑军 ，何川川 ，张雪萍 ，杨勇飞 ，李有文*

(1.塔里木大学 动物科学学院，新疆 阿拉尔 843300；2.新疆生产建设兵团 塔里木畜牧科技重点实验室，新疆 阿拉尔 843300；3.塔里木大学 生命科学学院，新疆 阿拉尔 843300)

羊痘是由羊痘病毒(capripoxvirus，CaPV)引起的山羊、绵羊的一种急性、热性接触性传染病[1]，临床表现为体温升高、鼻炎、皮肤呈红斑，严重时出现脓疮和疱疹等症状。本病世界各地均有发生，以非洲北部和中部、印度次大陆和亚洲的部分国家流行尤为严重[2]，我国多省份都有相关报道。本病为Ⅰ类疫病常呈暴发性流行，进入21世纪羊痘流行呈上升趋势，严重影响畜牧业生产及畜产品的国际贸易，给全球经济造成重大损失。

羊痘病毒是DNA病毒，基因组长达到150 kb，呈双股线形，是唯一在细胞浆内复制DNA病毒[3]。羊痘病毒属(capripoxvirus)包括绵羊痘病毒(sheeppoxvirus，SPPV)、山羊痘病毒(goatpoxvirus，GTPV)和皮肤疙瘩病病毒(lumpyskindiseasevirus，LSDV) 3个种，各毒种之间全基因核苷酸序列具有97%的同源性[4]。CaPV基因组含有147个(LSDV有156个)开放阅读框(ORFs)，分为中间保守区(024～123ORFs)和两端侧翼区(ORFs001～123和ORFs124～147)。侧翼区主要通过编码与病毒的毒力或种属相关的蛋白来参与病毒的修饰或逃避宿主免疫识别反应[5]。其中有3个Kelch-likeprotein(KLP)，分别是019，144和151ORFs(KLP1、KLP2、KLP3)。在进化过程中Kelch蛋白结构域十分的保守[6]。多个重复的Kelch基序所编码的蛋白称为Kelch样蛋白。每个KLP蛋白由3～7个不等的Kelch基序构成，每个Kelch重复结构元件由44～56个氨基酸长度的重复序列构成，里面包含8个高度保守的氨基酸[7]。结构分析证明它是由2个结构域组成无跨膜区，有2个较明显的疏水区。

酵母双杂交技术较灵敏简单快速而被广泛应用于筛选未知的互作蛋白。本试验制备了羊皮肤组织文库，首次用酵母双杂交系统以pGBKT7-KLP1为诱饵蛋白，经过对阳性克隆的多重报告基因检测、DNA测序和回转验证进行了互作蛋白的筛选，以期为进一步研究羊痘病毒毒力因子KLP1的生物学功能提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌株、质粒及载体DH5α、PET42b-KLP1载体均由塔里木畜牧科技兵团重点实验室保存；AH109酵母菌株、质粒pGBKT7、pGBKT7-53、pGADT7、pGADT7-T、DsRED-N1PEGFP-N1文库质粒pGADT7-NNJ-cDNA均购自Clontech公司；羊皮组织采自本地养殖户屠宰的健康绵羊。

1.2 试剂及仪器质粒小提取试剂盒、普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)；SfiⅠ酶(Fer-ments公司)；快速凝胶提取和PCR纯化组合试剂盒(Thermo，美国)；酵母质粒小提试剂盒、酵母双杂交试剂盒及各种营养缺陷型培养基(Clontech公司)；Trizol (invitriger公司)；Oligotex mRNA Kits(Qiagen公司)； PEG3350、LiAc、电泳仪、凝胶成像系统、智城恒温培养振荡器、梯度PCR机C1000、离心机、电转化仪、-80℃冰箱等。

1.3 羊皮肤组织酵母cDNA文库的构建羊皮肤组织mRNA的提取:Trizol法提取羊皮肤组织总RNA(根据说明书操作)，使用Oligotex mRNA Kits试剂盒分离纯化样本mRNA(根据说明书操作)，最后溶于8 μL的DEPC水中，取1 μL电泳检测D值。

酵母双杂交文库构建及质量鉴定：用mRNA合成cDNA合成(两步法)，经加5′接头(3个读码框，每个读码框连接1份，共3份)均一化处理，cDNA长度分离与载体pGADT7连接，电转化大肠杆菌感受态细胞等过程，获得酵母双杂交文库。从转化平板上随机挑取12个单克隆菌落，经PCR扩增后，电泳检测PCR产物大小。依据以下公式计算库容量：CFU / mL= 平板上的克隆数/10 μL × 100倍×1×103μL，文库总CFU= CFU/ mL×文库菌液总体积(mL)

酵母文库的质粒提取与保存：将转化后的原始文库菌液铺板，每块板铺1万～2万个克隆子，37℃过夜培养，第2天用液体培养基洗脱菌株，使用qiagen大抽试剂盒抽提质粒。文库需保存于-80℃冰箱内，可保存2年以上，文库质粒可以直接用于酵母文库筛选。

1.4 酵母诱饵质粒pGBKT7-KLP1的构建以PET42b-KLP1质粒为模板，用KLP1 的特异性引物(上下游各加入SfiI酶切位点,KLP1-F:aaGGCCATTACGGCCatgaagggcaaggaggagaagg;KLP1-R:ccGGCCGAGGCGGCCtcagtagtcctccacccagcca)PCR扩增得到KLP1基因后构建pGBKT7-KLP1诱饵重组质粒，利用SfiⅠ酶作酶切鉴定和测序鉴定。

1.5 诱饵质粒pGBKT7-KLP1自激活和毒性检测采用醋酸锂法将质粒pGBKT7-KLP1与pGADT7分别转化到AH109酵母感受态细胞，进行自激活检测(HIS3、ADE2和LacZ)，同时设阴阳性对照。HIS3和ADE2的检测是将转化子点板在SD-TLHA平板，30℃恒温培养4 d。LacZ的检测是从转化平板中挑6个菌落放在滤纸片并将其浸没放在液氮90 s后取出，室温放置2 min备用，将滤纸放在盛有显色液的平皿中，并覆盖冻溶后的滤纸，30℃黑暗中培养20 min后观察，2 h后会出现颜色的变化， 4～5 h时记录结果并拍照。通过观察菌落的生长状态判断是否有自激活，同时培养转化的pGBKT7-KLP1酵母菌并测定其D值。

1.6 酵母双杂交筛选KLP1蛋白的互作蛋白按酵母双杂交系统的说明书，将文库质粒pGADT7-WH转入包含对的pGBKT7-KLP1诱饵质粒的AH109酵母转化子受体菌中，制备感受态后涂SD-TLH平板缺陷平板，30℃培养3～4 d后观察，进行清除影印后挑取阳性菌落。分别用无菌水稀释上面SD-TLH缺陷型平板中初始结果为阳性的克隆进行ADE2、HIS3、LacZ报告基因检测。将在SD-TLHA和LacZ检测均为阳性的克隆提取质粒并测序，将测序的结果与GenBank数据库中的序列进行BLAST比对分析，确定候选互作蛋白基因。

1.7 筛选蛋白与KLP1相互作用的验证如1.3操作，将筛选确定的候选蛋白质粒分别与pGBKT7-KLP1诱饵质粒共转化AH109酵母菌感受态，涂布SD-TL平板上，随机各挑取6个菌落做LacZ报告基因的激活检测。

共定位鉴定:将KLP1基因插入DsRED-N1质粒，候选蛋白基因插入PEGFP-N1质粒，然后将2种质粒共转染到H293细胞，分别在同一视野下荧光倒置显微镜绿色和红色荧光下拍照，把2张照片放到一起，观察是否有共定位细胞。

2 结果

2.1 羊皮组织mRNA的提取分离采用Trizol法提取羊皮组织的总RNA，使用Oligotex mRNA Kits(Qiagen)分离纯化样本的mRNA电泳检测，结果为总RNA呈清晰的3个条带，mRNA呈弥散条带，主要集中在1 000 bp左右(图1)。

A.总RNA基因组电泳结果；B.mRNA基因组电泳结果；M.DNA Marker 5 000;1,2,3.羊皮组织样本mRNA

2.2 羊皮酵母cDNA文库构建及质量鉴定用mRNA合成cDNA合成，经加5′接头法与库载体pGAKT7连接，电转化大肠杆菌感受态细胞，得到酵母双杂交文库。依据库容量计量公式算提库容量为1.05×107CFU。通过PCR扩增，电泳检测其产物大小(图2)，插入的片段平均长度约为1 000 bp，文库的阳性率为100%。

M.DNA Marker 5 000;1～12.为羊皮肤组织酵母文库cDNA插入片段电泳结果

2.3 酵母文库质粒提取及文库保存将酵母文库菌液按每块板1万～2万个克隆子铺于35 cm的平板，培养洗脱后用qiagen大抽试剂盒抽提质粒，共提取得到210 μg去内毒素的高质量文库质粒(图3)，文库保存于-80℃冰箱内备用。

图3 酵母文库在平板上生长

2.4 酵母诱饵质粒pGBKT7- KLP1的构建按照分子克隆的方法构建的诱饵质粒PGBKT7-KLP1酶切鉴定结果见图4，后经测序结果显示载体构建正确，读码框正确。

M.DL5000 DNA Marker;1～3.为诱饵质粒PGBKT7-KLP1酶切电泳结果

2.5 诱饵质粒pGBKT7-KLP1自激活与毒性检测对诱饵质粒pGBKT7-KLP1与pGADT7共转化酵母菌AH109，分别经报告基因HIS3、ADE2和LacZ检验，与阴阳性对照试验，结果说明KLP1没有自激活作用(图5)，培养试验测定含pGBKT7-KLP1的酵母菌D值0.87，对酵母也没有毒性，可用于筛选互作蛋白。

pGBKT7-p53/pGADT7-largeT为阳性对照；pGBKT7-laminC/pGADT7-largeT为阴性对照

2.6 KLP1与宿主细胞互作蛋白的筛选将文库质粒pGADT7-WH转入含有正确pGBKT7-KLP1诱饵质粒的AH109酵母备感受态，经SD-TL和SD-TLHA两种营养缺陷培养基筛选培养得到19个候选克隆和LacZ报告基因检测，最终有11个通过检测(图6)。对19个候选克隆测序，与GenBank数据库中的序列进行BLAST比对分析，最终确定notch 1，protein phosphatase 4， transcript variant X3等9个蛋白作为KLP1互作的候选蛋白。

1～25分别是筛库得到的25个初始阳性克隆;“+”为阳性对照;“-”为阴性对照

2.7 筛选蛋白与KLP1相互作用的LacZ回转验证用以上测序确定的9种候选蛋白的质粒转化含pGBKT7-KLP1诱饵质粒的AH109酵母菌感受态，进行LacZ回转试验。结果显示，5个阳性克隆与诱饵克隆的回转验证对LacZ报告基因有激活作用(图7)。

2，5，8，9和10号对LacZ报告基因有激活作用

2.8 筛选蛋白与KLP1相互作用的共定位验证将两张照片重叠合并后(merge)，结果可见Notch1与KLP1在同一个细胞中进行了共定位，说明其具有互相作用的可能(图8)。

A.为PEGFP-Notch1;B.为DsRED-KLP1;C.AB组合共定位

3 讨论

蛋白质间的相互作用在生命活动中扮演着重要角色。酵母双杂交、双分子荧光互补(BiFC)、免疫共沉淀(Co-IP)、pull-down、荧光共定位等都可以研究蛋白质的相互作用[8]。其中酵母双杂交方法具有快速、适用性广泛、高敏感性的特点，本试验为构建高质量的羊皮肤组织cDNA文库，需选取新鲜的羊皮肤组织作为样品，分离和纯化样本mRNA期间要防止RNase酶污染。cDNA合成过程中第1链需要严格控制了各个阶段反应的温度，保证酶的最佳活性。cDNA片段通过采用公司酵母菌经典的醋酸锂转化方法转化效率很高，cDNA文库容量为1.05×107CFU，去内毒素的高质量文库质粒为210 μg，达到酵母双杂交技术互作蛋白的筛选要求。该系统多采用报告基因，本研究所选用的ADE2、HIS3、lacZ能够消除由于融合蛋白直接与GAL4结合位点或接近结合位点结合而产生的假阳性，同时也消除了融合蛋白结和到一个转录因子再结合到特定的TATA盒子所产生的假阳性[9]。但是该报告基因筛选出的是诱饵蛋白和序列片段之间的相互作用而不是完整的蛋白，因此也会出现假阳性还需双分子荧光互补等方法验证，如本试验测序后筛选出与KLP1互作的有9种蛋白但通过报告基因检测和共定位验证的只有1种。

本试验利用酵母双杂交技术从羊皮肤组织cDNA文库中筛选出与KLP1蛋白相互作用的9种蛋白，通过查阅这9种蛋白的相关文献，初步了解了其功能作用，经过LacZ回转验证和共定位试验验证，发现Notch1蛋白与KLP1蛋白具有特异的相互作用。Kelch蛋白家族种类众多生物功能广泛，不仅参与提供重要的信号传导途径，还可调控细胞周期以及肿瘤的发生，介导蛋白质之间的相互作用，参与蛋白质的降解[10]。BALINSKY 等[11]有研究发现绵羊痘病毒缺失ORF019的KLP基因后病毒毒力会大幅度下降，这表明KLP1是羊痘病毒十分重要的毒力因子，而Notch1作为Notch信号通路的单次跨膜受体蛋白，可以参与免疫应答调控、决定抗原呈递能力和细胞毒性的基因，与病毒的感染有关。AUDERCT等[12]表明小鼠的Notch1基因缺失后会抑制Th1细胞的分化从而更容易感染利士曼原虫。谢金玲[13]也发现机体感染幽门螺杆菌后Notch1的表达水平高。因此我们推测Notch1信号通路与山羊痘毒力因子KLP1感染机体后疾病的发生发展有关，但目前尚未见这2个蛋白相互作用机制的报道，通过本试验希望能为GTPV中KLP1互作蛋白的研究提供理论依据。