奶牛乳房炎性无乳链球菌药敏试验及毒力基因检测

刘 凯，顾小龙，张立梅，曲伟杰

(云南农业大学 动物医学学院，云南 昆明 650201)

奶牛乳房炎是奶牛养殖生产中最为常见的疾病,常见的奶牛乳房炎病原菌主要为金黄色葡萄球菌、链球菌和大肠杆菌等[1],而无乳链球菌(Streptococcusagalactiae,S.agalactiae)是奶牛乳房炎最重要的病原菌之一[2]。人们在奶牛乳房炎的防治上投入大量时间和财力，但是仍然没有解决根本上的问题，这给奶牛业造成巨大的经济损失，严重影响奶牛养殖业的总体发展。国内外对奶牛乳房炎病的报道较多，全球约有2.2亿头奶牛，其中1/3奶牛患有各类型乳房炎 ；国内关于乳房炎发病率的报道均在 46%～70%之间；在丹麦，平均每头奶牛每年的损失估计超过 200 美元；在美国每年因乳房炎造成的损失就达20亿美元，德国为4.5亿马克，中国每年此项损失为1.35亿元[3]。而目前治疗奶牛乳房炎最普遍的方法仍然是抗生素疗法，大量的抗生素在乳房炎中得到了广泛应用，然而在临床上奶牛乳房炎的防治中过度使用抗生素，导致细菌的耐药性也不断增强，导致“乳中残留”和“耐药菌株产生”等严重的公共卫生问题[4]。

无乳链球菌可携带多种与致病性和持续性感染相关的毒力因子，例如表面蛋白和黏附因子。目前，无乳链球菌的毒性基因中已经报道了Alp家族，CAMP因子、HylB，ScpB(C5a肽酶)、Lmb蛋白、FbsA、Sip蛋白和溶血素。致病细菌的毒性是侵袭性(包括入侵，黏附，定植，繁殖，传播和免疫逃避)和毒性(包括内毒素和外毒素)共同作用的结果[5]。

本试验是为调查山东的某奶牛养殖场奶牛乳房炎病例中无乳链球菌的感染状况和生物学特性,通过药物敏感性试验进行调查分析,为有效治疗该病及科学合理的使用治疗药物提供依据；检测其毒力基因携带情况，为其他地区无乳链球菌引发疾病的致病因素研究提供必要的基础。

1 材料与方法

1.1 病料来源山东某奶牛场3年左右泌乳期荷斯坦奶牛，乳区表现出红、肿、热、痛等典型的炎症反应，挤出乳汁中往往含有絮状凝乳块甚至含有血液，可综合诊断为患有临床型乳房炎。采集该厂奶牛乳样200份进行进一步细菌学检查及后续实验室检测。

1.2 主要试剂MHA琼脂培养基、爱德华培养基、细菌DNA提取试剂盒(离心柱型)、LB肉汤、5%绵羊平板、药敏试纸(青霉素、庆大霉素、万古霉素、氧氟沙星、氨苄西林、庆大霉素、新生霉素、氯霉素、头孢哌酮 、恩诺沙星、克林霉素、红霉素)、引物(上海生工生物有限公司合成)、Taq酶、DNA Maker、ddH2O、琼脂糖等均由本室保存。

1.3 主要仪器恒温水浴锅、恒温生化培养箱、超净工作台、高压灭菌器、离心机、微量移液器、PCR管、PCR扩增仪、凝胶电泳仪、凝胶成像系统 、超微量紫外光分光光度计。

1.4 细菌的分离培养先在5%绵羊血培养基上涂布乳房炎奶样于37℃培养24 h进行初步分离，将疑似链球菌菌落形态的单菌落接种于无乳链球菌选择培养基——改良爱德华培养基上进行进一步纯化鉴定，挑取疑似菌落(淡蓝色，菌落周围不变黑褐色)接种于5%马血清的LB液体培养基中摇菌过夜，保存备用。

1.5 提取细菌基因组使用“细菌基因组DNA提取试剂盒”提取无乳链球菌基因组DNA，具体操作方法依相应说明书。

1.6 引物的设计与合成进行PCR扩增与序列测定以无乳链球菌全基因组DNA为模板，然后参照 GenBank数据库中已报道过的无乳链球菌16S rRNA基因序列设计引物(表1)。将配好的反应溶液涡旋混匀，短暂离电后，进行PCR反应。PCR扩增反应结束后,其产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测并回收。测序结果与GenBank数据库中的序列进行同源性比对分析。

1.7 药敏试验药敏试验采用纸片扩散法。用微量移液器吸取稀释好的菌液(2×106CFU/mL)200 μL 滴于含5%马血清的MHA琼脂平板上，用经过灭菌处理的L型玻璃棒均匀涂布菌液，加盖静置15 min左右，待平板面稍干。用灭菌后的镊子分别将12种药敏纸片平放在含5%马血清的MHA琼脂平板上轻轻压紧，并置于37℃温箱培养过夜后观察结果。测量抑菌圈大小，按CLSI-2017说明书来判定主要病原菌对药物的敏感性。而所选抗菌药有:青霉素、庆大霉素、万古霉素、氧氟沙星、氨苄西林、庆大霉素、新生霉素、氯霉素、头孢哌酮 、恩诺沙星、克林霉素、红霉素等纸片共12种。

1.5 无乳链球菌毒力基因检测采用多重PCR进行无乳链球菌毒力基因定性检测。共采用2组体系(set1、set2)，分别检测cspA、pavA、cylE、hylB、lmb与pbp1A、bac、cfb、rib、fbs毒力基因。用表1中引物扩增各目的序列，将加好的反应溶液涡旋混匀，短暂离心后，进行PCR扩增反应。待PCR扩增反应完成后，将其产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳确认扩增的条带，对比参考图统计每株菌所携带毒力基因状况。

表1 PCR引物信息

2 结果

2.1 分离菌株DNA提取结果无乳链球菌提取的DNA经琼脂糖凝胶电泳检测与超微量紫外光分光光度计分析，结果表明提取的DNA纯度高,可作为PCR扩增的模板进行测序。

2.2 药敏结果本试验从奶牛乳房炎中分离出的42株无乳链球菌，有针对性的选择12种药进行药敏试验，表2是药敏试验抑菌圈直径判定标准,而表3为药敏试验药物敏感性的结果，根据表2，3得出表4无乳链球菌药物敏感试验判定表。42株菌株对抗生素药物都产生了不同程度的敏感性，尤其对庆大霉素、万古霉素、氧氟沙星、恩诺沙星的敏感率最高,为100%;其次是氯霉素、氨苄西林、克林霉素、红霉素，达到了97.6%；而青霉素为83.3%、头孢哌酮为64.2%。

表2 药敏试验仰菌圈直径判定标准

表3 42株无乳链球菌分离菌株药物敏感性试验结果 mm

续表3

表4 42株无乳链球菌药物敏感试验判定表

2.3 分离菌株16S rDNA鉴定无乳链球菌PCR扩增产物经凝胶电泳分析后，均在400 bp处出现单一条带,通过16S rRNA基因扩增-测序-NCBI比对，相似度达99.9%以上，最终确认为无乳链球菌。

2.4 分离菌株毒力基因检测结果由表5可知，对42个分离的无乳链球菌菌株针对10个毒力基因进行检测和测序的结果是，pavA，cylE，hylB，pbplA，cfb和fbsA的基因检出率为100%，lmb的基因检出率为97.62%，cspA基因检出率为31%，未检出bac和rib基因。

表5 毒力基因在无乳链球菌中的分布

3 讨论

奶牛乳房中乳腺组织经在一些化学、物理和微生物等一系列外界刺激引起的炎性变化被称为奶牛乳房炎[7]。它不仅影响奶牛的产奶量和奶的品质,还降低奶牛的养殖经济效益。而多种病原微生物是引起奶牛乳房炎的主要原因,且多为混合感染,其中链球菌是最常见的一种病原菌[8]。在球菌引起的乳房炎中,具有高度传染性的专性乳腺寄生菌就是无乳链球菌[9]。而如今，随着大量抗生素的开发和滥用，导致细菌的耐药性增强，这也是导致奶牛乳房炎防控效果不佳的原因之一。

无乳链球菌是易感染人类、家畜和水生动物的条件性致病菌，有多种内毒素及表面蛋白对无乳链球菌的致病性起促进作用。这些致病因子使无乳链球菌具有很强的吸附作用、免疫逃逸能力和抗宿主免疫细胞吞噬[5]。参与宿主细胞附着的毒力因子包括scpB，lmb，fbsA和fbsB，其中scpB基因编码为C5a肽酶，lmb基因编码为层黏连蛋白结合蛋白，fbsA的编码为纤维蛋白原结合蛋白A，fbsB的编码为纤维蛋白原结合蛋白B。与侵袭相关的毒性因子为cylE，cfb，hylB，rib和bac。有研究表明，毒性基因cfb编码为CAMP因子，这种毒力基因能够与免疫球蛋白IgG和IgM的Fc片段相结合，以激活IgG和IgM的Fab片段，从而在机体系统感染期间削弱宿主的免疫功能。据报道无乳链球菌中cfb的检出率为99.4%，这证明了CAMP因子在无乳链球菌引起的奶牛乳房炎的发生起非常重要的作用[10]。

在这次药敏试验过程中,奶牛乳房炎的无乳链球菌对绝大部分的抗生素都高度敏感，对庆大霉素、万古霉素、氧氟沙星的敏感率最高(100%)，其次为氨苄西林、克林霉素、氯霉素、红霉素(97.6%)，说明这些抗生素效果很好，而临床常用的青霉素类、头孢类在本试验中效果不理想，这可能与临床上使用药物次数过多有关，从而给奶牛乳房炎的治疗带来一定困难[11-13]。结合本试验结果为该牧场制定具有针对性的用药方案，经过一个治疗周期的用药，患有临床型乳房炎的奶牛治愈率达90%以上。由于抗生素的长期大量使用,致使乳房炎病原菌的耐药性不断增强,乳房炎的发生率不断升高,这也给乳房炎的防治造成了极大的困难。从国内外防治经验来看,使用疫苗免疫是预防奶牛乳房炎最有效的措施[14]。而毒力基因检测验结果显示，无乳链球菌主要毒力因子pavA，cylE，hylB，pbplA，cfb和fbsA的检出率为100%，表明奶牛乳房炎的致病过程里，这些毒力因子参与其中，后续研究中以上几种毒力基因所表达的蛋白可作为疫苗开发备选因子。而本试验未检出bac和rib基因，以及cspA基因检出率较低，可能是这种基因不是该奶牛场主要的致病因子。