去甲基化酶KDM4B在牦牛卵泡发育过程中的表达

马鸿程，熊显荣，海 卓，闵星宇，郝振宇，李 键

(1.西南民族大学 畜牧兽医学院，四川 成都 610041；2.青藏高原动物遗传资源保护与利用教育部重点实验室，四川 成都 610041；3.动物科学国家民委重点实验室，四川 成都 610041)

牦牛(Bosgrunniens)主要分布于我国海拔3 000 m 以上的高原地区，其对低氧恶劣生存环境具有极强的适应性，是当地牧民生产生活的重要资源之一。然而牦牛产业发展相对缓慢，严重限制当地的经济发展，其主要原因在于牦牛性成熟晚、繁殖周期长，繁殖性能较普通黄牛低下[1]。因此，开展牦牛繁殖方面的研究对丰富我国遗传资源多样性以及提高当地牧民的生活水平具有重要的价值。

卵巢是雌性牦牛重要的生殖器官，主要支持卵泡发育以及卵母细胞的生长和成熟[2]。包括颗粒细胞在内的多种体细胞通过间隙连接，在各种激素、蛋白质、细胞因子及卵泡内外环境的共同作用下直接或间接的参与卵泡发育[3]。与颗粒细胞中直接调节类固醇生成进而参与卵泡发育的相关分子相比，表观遗传通过间接方式在卵泡发育过程中起着必要的调控作用[4]。组蛋白赖氨酸甲基化修饰作为重要的表观遗传修饰方式之一，通过组蛋白甲基化酶(HMTs)和去甲基化酶(HDMs)相互协调作用于氨基酸残基特定位点。组蛋白去甲基化酶家族由大约24个基因组成，可分为7个功能不同的亚家族。KDM4B是KDM4/JMJD2亚家族成员，该家族有KDM4A～KDM4E 5个成员[5]。KDM4B蛋白结构与KDM4A、KDM4C相似，均包含1个JmjC结构域、1个JmjN结构域、2个植物同源结构域(PHD)和2个Tudor结构域，其中JmjC结构域的酶功能依赖于α-酮戊二酸(α-KG)、Fe(Ⅱ)和分子氧作为去甲基化反应的辅因子，而JmjN结构域可以作为二聚体结构域并提供结构完整性[6-7]。牦牛KDM4B基因共编码1 116个氨基酸[8]，与KDM4亚家族的其他成员一样，KDM4B可以将二甲基(me2)和三甲基(me3)赖氨酸脱甲基为单甲基(mel)状态，对组蛋白残基H3K9me3、H3K9me2、H3K36me3、H3K36me2、H4K20me2和H1.4K26me3均具有催化活性，其中H3K9me2/3是KDM4B的首选底物[9-10]。KDM4B在哺乳动物各组织器官中广泛表达，尤其在卵巢、睾丸等生殖器官中高表达[11]，研究发现KDM4B表达量在精子发生前增加同时H3K9me3显著减少[12]；另外KRIEG等[13]研究表明，卵泡细胞中KDM4B mRNA及蛋白表达与患者能否成功体外受精相关。提示KDM4B参与生殖过程调控。

目前关于KDM4B基因的研究主要集中在前列腺癌[14]、乳腺癌[15]等癌症方面，在卵巢组织及其功能中的研究较少。而作为重要的去甲基化酶之一，KDM4B是否参与牦牛卵泡发育调控仍未知。因此，本研究以牦牛卵巢为对象进行免疫组织化学染色，分析KDM4B蛋白在卵泡发育进程中的表达定位，同时进行牦牛卵泡直径大小与卵母细胞成熟率及卵泡细胞(卵母细胞、卵丘颗粒细胞及壁层颗粒细胞)中KDM4B mRNA表达量的相关性分析，为深入研究KDM4B基因在调控卵巢卵泡发育及卵母细胞减数分裂中的作用机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂Trizol Reagent、Single Cell-to-CTTMKit微量RNA提取试剂盒购自美国Invitrogen公司；PrimeScrptTMRT Reagent Kit 反转录试剂盒、2×Phanta®Max Master Mix(Dye Plus)由南京诺唯赞提供；0.5%透明质酸酶(0.5 g透明质酸酶粉末、100 mL Medium199)、卵母细胞成熟液OM培养液(10%胎牛血清、Medium 199培养基)均购自赛默飞公司；1 mg/L促卵泡素(follicle-stimulating hormone,FSH)、1 mg/L促黄体素(luteinizing hormone,LH)购自Vetoquinol公司；1 mg/L 17β-雌二醇(17β-estradiol,E2)；0.02 g/L丙酮酸钠(C3H3NaO3)和0.03 g/L谷氨酰胺(glutamine,Gln) 均购自Sigma公司。

1.2 卵巢样本采集卵巢样本采自四川省广汉市屠宰场。3～5岁健康雌性牦牛(n=9)，屠宰后立即无菌采集卵巢组织，用含有双抗(80 mg/L 青霉素和100 mg/L链霉素)的生理盐水将采集到的卵巢冲洗干净并随机分为2组，1份用4%多聚甲醛固定液固定(用于后续免疫组织化学)，另1份投入保温瓶(含37℃生理盐水、双抗)中于3 h 内带回实验室。用37℃生理盐水将卵巢冲洗数遍，根据卵泡直径大小将卵泡分为大卵泡组(≥7 mm)、中卵泡组(3.0～6.9 mm)、小卵泡组(≤2.9 mm)，共3组。用12号针头注射器抽取卵泡液置于90 mm平皿，在体视显微镜下按组收集卵丘-卵母细胞复合物(cumulus-oocyte complex,COCs)，部分在卵母细胞成熟液中冲洗数遍，0.5%透明质酸酶脱颗粒后分别收集卵母细胞(每组15枚)和卵丘颗粒细胞，其余COCs进行体外成熟培养。各组卵泡液离心后得到卵泡壁层颗粒细胞，用PBS洗涤数次后，-80℃保存备用。

1.3 牦牛卵巢组织中KDM4B的定位及表达取出固定于4%多聚甲醛固定液中的卵巢组织进行免疫组化法检测KDM4B蛋白表达及定位。PBS洗净固定液后进行浸蜡包埋制作成石蜡切片。染色前将切片置于60℃恒温箱烘烤1～2 h后，依次使用二甲苯和乙醇脱蜡(6 min，3次)，然后蒸馏水洗2次各5 min；3%H2O2于室温中避光孵育30 min，以封闭内源性过氧化酶；再用pH7.4的PBS冲洗3遍后用5%胎牛血清封闭，滴加多克隆兔抗KDM4B抗体(BIOSS公司，100倍稀释)4℃孵育过夜。PBS重复冲洗2次各5 min，后加多聚化山羊抗兔IgG于37℃孵育90 min；DAB(PBS 1 000 μL、DAB储备液20 μL、3%H2O25 μL)显色10～15 min；室温下苏木精复染30 s后进行脱水及透明，中性树胶封片；显微镜下观察拍照。以褐色或棕褐色判定为阳性细胞，颜色越深指示蛋白表达越强。

1.4 卵母细胞成熟培养在体视显微镜下选取结构紧密、细胞质均匀无皱缩，卵丘细胞致密的COCs，并用提前在培养箱中平衡10 h的OM培养液清洗2次。将包含GV期卵母细胞的COCs转入平衡10 h的l mL OM成熟液中置于饱和湿度100%、二氧化碳5%的38.5℃恒温培养箱中进行培养。连续培养24 h后用0.5%透明质酸酶脱颗粒，观察第1极体排出率(以此标准来判定卵母细胞的减数分裂成熟)。

1.5 总RNA提取及反转录收集的卵母细胞严格按照Single Cell-to-CTTMKit试剂盒说明书合成cDNA，保存于―20℃备用。将卵丘颗粒细胞及壁层颗粒细胞严格按照Trizol法说明书步骤提取总RNA，核酸浓度仪检测其浓度和D值后，选择D值在1.8～2.0的RNA作为模板，按照TaKaRa公司PrimeScriptTMRT Reagent Kit反转录试剂盒说明书合成cDNA，-20℃保存备用。

1.6 引物设计及合成根据NCBI数据库中GenBank所公布牦牛KDM4B基因的mRNA序列(MH510242.1)及GAPDH mRNA序列(AC-000162.1)，利用NCBI(Primer-BLAST在线工具包)设计荧光定量引物，由南京金斯瑞生物科技公司合成，序列见表1。

1.7 牦牛KDM4B 基因在卵泡细胞中的表达以GAPDH作为内参基因，采用RT-qPCR方法检测牦牛不同大小卵泡中卵母细胞、卵丘颗粒细胞及壁层颗粒细胞KDM4B mRNA的表达。将cDNA模板质量浓度调整一致(40 mg/ L)，以保证数据准确。反应体系为15 μL：SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ7.5 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，ddH2O补足至15 μL。反应条件为：94℃预变性4 min，94℃变性45 s，59℃退火1 min，72℃延伸1 min，35个循环，72℃ 7 min。引物见表1，重复3次。

表1 引物信息

1.8 数据分析每组试验重复3次，荧光定量结果用2-△△Ct均一化处理，采用SPSS 18.0软件进行方差分析，ANOVA显著性差异分析。P>0.05为差异不显著，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

2 结果

2.1 KDM4B蛋白在牦牛卵巢组织中的表达与定位采用免疫组织化学方法检测KDM4B蛋白在牦牛卵泡发育进程中的表达及定位。结果显示，KDM4B蛋白在牦牛各发育时期卵泡中均有表达(图1)。以褐色或棕褐色判定为阳性表达，主要见于牦牛原始卵泡(图1A)、初级卵泡(图1B)、次级卵泡(图1C)、三级卵泡(图1D)以及优势卵泡(图1E,F)，其中优势卵泡中呈强阳性表达。同时发现KDM4B蛋白主要定位于卵母细胞及颗粒细胞(GC)，而卵泡膜细胞(TC)中表达量较少。

A.原始卵泡(×100)；B.初级卵泡(×80)；C.次级卵泡(×80)；D.三级卵泡(×50)；E.优势卵泡(×50)；F.E的局部放大(×100);GC.颗粒细胞；TC.膜细胞

2.2 卵泡大小与卵母细胞成熟率关联性分析对各组卵泡中卵母细胞分别进行体外成熟培养，每组进行3次生物学重复并统计成熟率。结果显示，卵母细胞卵丘扩展能力在小卵泡时期最差，中卵泡时期最强，而大卵泡中部分卵母细胞周围的卵丘细胞致密度不如中卵泡时期。卵母细胞体外成熟率随卵泡发育呈显著上升趋势，大卵泡组成熟率为91.30%、中卵泡组成熟率为85.77%、小卵泡组成熟率为63.51%。其中大卵泡组、中卵泡组成熟率显著高于小卵泡组(P<0.05)，但大卵泡、中卵泡组间成熟率差异不显著(P>0.05)(表2)。

表2 卵母细胞成熟率

2.3 牦牛不同发育阶段卵泡细胞中KDM4B mRNA表达分析以内参基因GAPDH作为参照，利用RT-qPCR方法检测不同发育阶段牦牛卵泡卵母细胞及其相对应卵丘颗粒细胞、壁层颗粒细胞中KDM4B基因的表达情况。结果显示，KDM4B mRNA在牦牛不同发育阶段卵泡细胞中呈动态表达(图2)。随着卵泡发育，卵母细胞中KDM4B基因表达量呈现下降趋势，且中卵泡、大卵泡组卵母细胞中表达量显著低于小卵泡组(P<0.05)，但它们两组间差异不显著(P>0.05)；不同组别卵泡中卵丘颗粒细胞与壁层颗粒细胞KDM4B基因表达量变化规律基本一致，即表达量随卵泡发育程度呈现明显的上升趋势，其中，中卵泡、大卵泡组2种细胞中KDM4B表达量均极显著高于小卵泡组(P<0.01)，同时以各组别壁层颗粒细胞中表达量作为参照，卵丘颗粒细胞中表达量约为同时期壁层颗粒细胞中的2倍(P<0.01)。

图2 牦牛不同发育阶段卵泡细胞中KDM4B mRNA的表达水平

3 讨论

核小体被认为是染色质的基本重复单位，是由组蛋白H2A、H2B、H3、H4及DNA组成的八聚体。组蛋白通过包括甲基化在内的组蛋白尾部翻译后修饰方式来调节DNA在转录机制中的功能。组蛋白赖氨酸甲基化是一个既能调节转录激活又能调节转录抑制的动态过程，在表观遗传中起着不可或缺的作用。研究表明，组蛋白去甲基化在DNA损伤[16]、造血干细胞维持[17]、脂肪代谢[18]及葡萄糖代谢[19]等多种生物学过程中发挥重要的调控作用。同时，去甲基化酶在生殖调控过程中扮演着重要的角色，如KDM1A通过在颗粒细胞及卵母细胞中的差异表达对卵泡发育起正向调控作用[20]。但目前关于KDM4B在雌性牦牛生殖调控中的作用研究国内外均未见报道。因此，探索KDM4B基因在牦牛卵泡发育中的表达模式对进一步研究组蛋白去甲基化在牦牛生殖中的作用机制具有重要意义。

本试验通过免疫组织化学方法检测了KDM4B蛋白在牦牛卵泡发育进程中的表达及定位，发现从原始卵泡到优势卵泡的各发育阶段中，KDM4B蛋白均有表达，其主要定位于卵母细胞及颗粒细胞，且表达强度随着卵泡发育增加，发育至优势卵泡时呈强阳性表达。KRIEG等[13]对体外受精患者的卵巢进行免疫组织化学检测，发现KDM4B蛋白主要定位于各发育阶段卵泡中的卵母细胞、壁层颗粒细胞(GCs)及卵丘颗粒细胞(CCs)，且各时期卵丘颗粒细胞中的表达量高于其他卵泡细胞，这种动态的差异表达与卵母细胞能力密切相关。本试验牦牛卵巢中KDM4B蛋白表达模式与其研究结果基本一致，提示KDM4B蛋白同样在牦牛卵泡发育过程中发挥着重要的作用。

卵泡发育起始于胎儿时期，这是一个连续的、选择性的过程，直到初情期后部分卵母细胞在卵泡内外环境共同作用下开始逐渐成熟并排卵[21-22]。卵泡发育程度以及颗粒细胞增殖分化对卵母细胞成熟率至关重要。本试验首先对获取于牦牛不同直径卵泡中的卵母细胞进行体外成熟培养，发现随着卵泡发育进程卵母细胞成熟率明显上升，且小卵泡组成熟率显著低于中卵泡组和大卵泡组。原因可能是成熟卵泡细胞中mRNA及蛋白储存水平更高，颗粒细胞等卵泡细胞通过缝隙连接蛋白为卵母细胞提供更加良好的生长环境进而促进其发育成熟[3]。研究发现KDM4B通过调节相关生长转化因子(如转化生长因子-β/TGF-β等)的表达来激活通路，在颗粒细胞与卵母细胞相互调控中起着重要作用，进而影响卵母细胞发育成熟[23-24]。此外，KDM4B是雌激素依赖性基因表达的重要因素，同时有腔卵泡CCs中雌激素受体β(ER-β)表达量与卵母细胞成熟率呈正相关[25-26]。由此可知KDM4B可能对卵泡卵母细胞的发育具有一定的影响。

为进一步探究KDM4B基因在这一过程中的作用，本试验运用RT-qPCR方法检测了各组卵泡细胞中KDM4B mRNA的表达，结果表明其mRNA在各组卵泡卵母细胞、CCs及GCs中均有表达。其中卵母细胞中KDM4B mRNA表达趋势与卵母细胞体外成熟率相反，即随卵泡发育程度表达量呈下降趋势，这可能与卵母细胞减数分裂进程恢复有关。研究发现随着卵泡发育进程，卵母细胞减数分裂恢复，P53的表达在这一过程中逐渐升高[27]，而LI等[28]发现干扰KDM4B表达会激活胃癌细胞中的P53，推测KDM4B作为P53的负调节因子而促进卵母细胞减数分裂成熟。因此卵母细胞中KDM4B表达随卵泡发育而下降，减数分裂恢复使大卵泡中卵母细胞成熟率最高。随着卵泡腔的形成，颗粒细胞逐渐分化形成直接包绕在卵母细胞周围的CCs及紧贴着腔壁的GCs[29]。本试验结果发现各组卵泡CCs、GCs中KDM4B表达规律一致，均随卵泡发育呈明显的上升趋势。研究已证实颗粒细胞表面的雌激素受体(ER)及雄激素受体(AR)分别与雌激素和雄激素结合，对颗粒细胞的增殖分化起正向调控作用。同时KDM4B是ER信号转导级联的主要调节剂，其还通过抑制AR泛素化来增强AR蛋白的稳定性[25,30]。另有研究发现，低氧诱导因子HIF-1α在小鼠不同发育阶段颗粒细胞中均有表达，且表达量随卵泡发育增强[31]。同时POLLARD等[32]研究表明KDM4B是由HIF-1α从位于转录起始位点上游约500 bp的缺氧反应原件(HRE)直接诱导的。因此，颗粒细胞中KDM4B在核激素受体及HIF-1α的作用下调节颗粒细胞增殖分化，随颗粒细胞增多进而促进卵泡发育及卵母细胞成熟。此外本研究发现，各组CCs中KDM4B相对表达量均高于同组GCs。研究表明与GCs相比，CCs在卵母细胞发育过程中提供了更多的营养，CCs缺失会严重影响卵母细胞的成熟[33-34]。推测KDM4B在CCs中表达量更高是由于其在CCs与卵母细胞间的分子交换过程中起着更加关键的作用，具体调节方式有待进一步验证。综上，KDM4B对卵母细胞及颗粒细胞有着不同的调节机制，通过促进卵母细胞减数分裂及颗粒细胞增殖分化进而参与卵泡发育调控。

本试验首次通过免疫组化法及RT-qPCR法检测了KDM4B在牦牛卵泡发育进程中的表达。结果显示,KDM4B蛋白在牦牛卵泡各发育阶段均有表达，其中优势卵泡表达信号最强。不同大小卵泡卵母细胞中KDM4B mRNA表达趋势与体外成熟率相反，随着卵泡发育其表达量明显下降。颗粒细胞中KDM4B mRNA表达随卵泡发育呈上升趋势。表明KDM4B基因参与卵泡发育调控，在卵母细胞减数分裂成熟及颗粒细胞增殖分化中发挥重要作用，具体调控机制有待进一步研究。