吡非尼酮对新西兰兔膝关节创伤后瘢痕挛缩的改善作用

张永光，盛青松，邱 卓，胡建伟，陈建梅，叶永平

瘢痕是机体在创伤后组织修复过程中的必然产物[1]。由于全身或局部多种因素的影响，瘢痕组织往往过度增生而具有较强的收缩性，可使肢体的正常解剖结构遭到破坏，导致关节畸形、功能障碍等[2]。创伤后关节囊周围瘢痕粘连及挛缩是膝关节屈伸功能受限的重要原因，严重影响患者的生活质量[3]。对于涉及滨海及远洋作业人群，膝关节创伤后因高渗海水浸泡及难以及时救治等多重因素，瘢痕挛缩所致功能受限更为明显，致畸致残率更高。因此，海水浸泡膝关节创伤后瘢痕挛缩是亟待解决的临床难题[4]。目前。此类研究尚少见于报道。

吡非尼酮(Pirfenidone，PFN)是一种具有抗炎、抗氧化和抗纤维化作用的新型小分子化合物，对于特发性肺纤维化具有良好的疗效[5]。然而，关于吡非尼酮治疗膝关节创伤后瘢痕挛缩却未有报道。本实验探索通过口服吡非尼酮改善海水浸泡动物膝关节创伤性瘢痕，观察其对增生性瘢痕的影响，通过组织Masson染色和标本ELISA检测进一步观察其治疗效果，并初步探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 吡非尼酮(大连美仑生物技术有限公司)，速眠新与苏醒珍(长沙拜特生物科技研究所)，多聚甲醛(国际集团化学试剂有限公司)，兔羟脯氨酸(Hyp)ELISA试剂盒(酶免，MM-36861O2)，苏木精染色液(Solarbio)，伊红染色液(大连美仑生物技术有限公司)，无水乙醇(西陇科学股份有限公司)，二甲苯(西陇科学股份有限公司)，中性树胶(biosharp)，小鼠/兔IgG-免疫组化试剂盒SABC即用型(SA1020，BOETER)，DAB显色试剂盒(AR1022，BOETER)，Masson染色三色试剂盒(G1340，SoLarBio)，TGF-β1(21898-1-AP，Proteintech)，KH-TS型自动组织脱水机(湖北孝感阔海医疗科技有限公司)，KH-BL型包埋机(湖北孝感阔海医疗科技有限公司)，KH-BL型包埋机冷台(湖北孝感阔海医疗科技有限公司)，轮转式切片机(赛默飞世尔仪器有限公司)，摊片烤片机(湖北孝感阔海医疗科技有限公司)，黏附载玻片(江苏世泰实验器材有限公司)，超纯水机(Millipore 超纯水机)。

1.2 动物分组与手术 普通级雄性新西兰兔20只(约2.2 kg，上海市松江区松联实验动物场，许可证号码：SCXK[沪]2017-0008)。实验前适应性喂养7 d，规律喂食、饮水。按照随机数字表法将新西兰兔分为四组：生理盐水组(NS组)，无菌海水组(SW组)，生理盐水+ PFD治疗组(NS+PFN)，无菌海水+PFD治疗组(SW+PFN)，每组5只。膝关节手术过程如下：选取兔子右侧大腿肌肉注射速眠新(0.1～0.2 ml/kg)麻醉。进入手术麻醉状态后，用剃毛器去除左腿膝关节周围的毛，将兔子固定在小动物手术台上，75%乙醇、碘伏消毒术野；无菌刀片沿髌旁内侧纵行做长4 cm的膝关节切割伤口，逐层切开至关节腔，暴露关节软骨面，伤后患肢无菌纱布压迫止血。将兔膝关节创口于无菌生理盐水/无菌海水中浸泡1 h，浸泡结束后给予生理盐水冲洗关节腔，依次缝合创口，无菌纱布包扎。给予兔子右大腿注射0.2 ml苏醒珍，待兔子苏醒后放回笼中饲养。吡非尼酮治疗组(NS+PFN组和SW+PFN组)动物予吡非尼酮(0.75 g)与饲料混合喂养，每天给药1次。NS组和SW组仅给予饲料喂养。术后4周深度麻醉动物后取材。将关节液保存于-80 ℃冰箱；髌上囊与关节周围瘢痕组织用4%多聚甲醛固定液固定后保存于室温。所有动物实验过程均符合实验动物伦理并经由第九〇〇医院伦理委员会批准实施。

1.3 Masson染色 用配制好的weigert铁苏木精染色液染色7 min。酸性乙醇分化液分化10 s，水洗。Masson蓝化液返蓝3 min，水洗。蒸馏水洗1 min。丽春红品红染色液染色30 s。在上述操作过程中按蒸馏水：弱酸溶液=2∶1比例配置弱酸工作液，用弱酸工作液洗1 min。磷钼酸溶液洗2 min。用配置好的弱酸工作液洗1 min。使用苯胺蓝染色液滴加1 min。用配置好的弱酸工作液洗1 min。95%乙醇快速脱水。无水乙醇脱水3次，每次15 s。二甲苯透明10 min。中性树胶封片。

1.4 羟脯氨酸含量检测 从室温平衡 20 min 后的铝箔袋中取出所需样本。设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50 μl；样本孔中加入待测样本 50 μl；空白孔不加。除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体 100 μl，用封板膜封住反应孔，37 ℃水浴锅或恒温箱温育60 min。弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液(350 μl)，静置 1 min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次。每孔加入底物A、B各50 μl，37℃避光孵育15 min。 每孔加入终止液50 μl，15 min内，在450 nm 波长处测定各孔的OD值。

1.5 TGF-β1含量检测 将获取的新鲜标本加入磷酸缓冲盐溶液，匀浆充分，离心，收集上清液。稀释后各孔加样量50 μl。加样时设空白孔与样品孔。样品孔中先加入40 μl样品稀释液，然后加入10 μl待测样品。加样过程中，注意将样品加于酶标板孔的底部，不触及酶标板孔的孔壁，摇晃混匀。加酶，除空白孔外每孔加入酶标试剂溶液 50 μl，空白孔不加酶。封板后将酶标包被板放入 37 ℃温箱中温育30 min。使用蒸馏水将30倍浓缩洗涤液稀释30倍后备用。从温箱中取出酶标包被板，去除封膜，弃去液体，甩干，然后使用洗涤液将每孔加满，静置 30 s后弃去，此步骤重复5次，最后拍干。每孔加入显色剂 A 50 μl，再加入显色剂B 50 μl，摇晃混匀后放入避光处显色10 min，温度保持在 37 ℃。 酶标包被板上的每孔加入终止液50 μl，结束反应过程。以空白孔调零，450 nm 波长依序测量各孔的OD值。

2 结 果

2.1 大体观察 术后以丝线缝合切口，各组动物切口3 d左右干燥结痂，无明显渗出，切口周围皮肤无红肿。1周左右线结脱落，愈合良好，切口无裂开、溃疡、感染等情况。

2.2 Masson染色结果 如图1所示，在NS组和SW组，胶原纤维粗大，呈螺旋状排列，结构表现为致密而紊乱状；在吡非尼酮处理组(NS+PFN组和SW+PFN组)，胶原纤维分布相对稀疏，大致呈平行排列，相对更为规则。

图1 瘢痕组织Masson染色结果(×100)

2.3 羟脯氨酸水平 检测结果显示，在SW组、NS组、SW+PFN组和NS+PFN组，羟脯氨酸分别为(114.20±14.54)ng/ml、(99.21±18.27)ng/ml、(87.91±12.02)ng/ml和(76.17±18.72)ng/ml，水平逐渐降低。SW+PFN组羟脯氨酸水平明显低于SW组(P<0.05)。

2.4 TGF-β1水平 检测结果显示，SW组和NS组TGF-β1水平分别为(151.53±20.21)ng/ml和(141.72±4.14)ng/ml。经吡非尼酮干预后，SW+PFN组和NS+PFN组TGF-β1水平相对降低，分别为(106.53±12.86)ng/ml和(92.03±10.05)ng/ml。SW+PFN组TGF-β1水平明显低于SW组，差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨 论

膝关节是人体最大的关节，负重多且运动量大[6]。由于膝关节的关节面大且部位表浅，杠杆作用最强，不稳定而易受伤。膝关节损伤后，出现功能障碍的一个主要原因在于关节囊周围组织的瘢痕粘连及挛缩，导致膝关节屈伸功能受限[7]。严重的膝关节瘢痕挛缩会导致膝关节功能丧失，严重影响患者的生活质量，对个人、家庭及社会造成了严重负担[8]。滨海地区涉海及远洋作业人群庞大，膝关节创伤后因高渗海水浸泡及难以及时救治等多重因素，膝关节创伤更为严重，后期瘢痕挛缩致功能受限更为明显，导致患者致畸致残率更高。此外，沿海部队渡海登岛演练亦存在膝关节创伤海水浸泡、瘢痕挛缩致畸致残等情况[9, 10]。故此，解决膝关节创伤后周围瘢痕问题，探索一条治疗海水浸泡膝关节损伤的行之有效的方法，具有重要的临床实践意义。

瘢痕是人体在创伤后组织修复过程中的必然产物，任何创伤的愈合均伴有不同程度的瘢痕形成[11]。在组织修复过程中，由于全身或局部多种因素的影响，常出现瘢痕组织的过度增生而形成增生性瘢痕。增生性瘢痕具有较强的收缩性，可使膝关节的正常解剖结构遭到破坏，导致创伤性关节畸形和功能障碍[12]。增生性瘢痕的形成往往是多因素共同作用的结果。一般认为成纤维细胞的大量增殖与凋亡抑制，细胞外基质中胶原合成与降解失衡在瘢痕形成过程中发挥关键作用[13]。此外，机体受损后，成纤维细胞激活、增殖，转化成表达α-平滑肌肌动蛋白(α-Smooth muscle actin，α-SMA)的肌成纤维细胞，分泌产生多种生长因子和细胞外基质。

在肌成纤维细胞分泌的生长因子中，研究较多的是 TGF-β1，它是目前已知的与增生性瘢痕形成关系最密切的细胞因子[14]。TGF-β1的主要生物学功能是调节细胞的增殖和结缔组织的合成。在成纤维细胞中，TGF-β1刺激细胞外基质蛋白的合成与沉积，抑制胶原酶的产生，并能增加胶原酶抑制剂的产生。TGF-β1除能导致组织纤维化，也能诱导肌成纤维细胞高表达 α-SMA[15]。也就是说修复细胞中成纤维细胞的大量增殖与凋亡抑制，细胞外基质中胶原合成与降解失衡，部分生长因子的大量产生及三者之间相互协调的关系构成了增生性瘢痕形成的生物学基础。因此，促进肌成纤维细胞的凋亡和细胞外基质降解、抑制胶原的合成和 TGF-β1的过表达对于治疗增生性瘢痕来说至关重要。

在本研究中，我们将吡非尼酮应用于海水浸泡后的膝关节创伤动物模型实验中。通过组织学观察和免疫学测定，结果表明吡非尼酮抑制了海水浸泡后膝关节伤口愈合过程中的胶原合成，缓解了瘢痕粘连。膝关节损伤经海水浸泡后，在对照组，胶原纤维粗大，呈螺旋状排列，结构表现为致密而紊乱状；在吡非尼酮处理组，胶原纤维稀疏而排列相对规则，大致平行。胶原是瘢痕组织的重要组成部分，主要由成纤维细胞合成和分泌。羟脯氨酸是胶原蛋白的主要组成氨基酸，占胶原纤维氨基酸含量的12.5%，其含量测定可以反映瘢痕组织中胶原的形成。ELISA测定结果表明，SW+PFN组羟脯氨酸水平明显低于SW组，表明吡非尼酮可能抑制了创伤后胶原蛋白的合成，从而缓解了创伤后瘢痕的过度增生。TGF-β1是肌成纤维细胞分泌的与瘢痕过度形成关系最密切的细胞因子。吡非尼酮属于细胞因子抑制药，在临床上已经成为治疗特发性肺纤维化的一线药物。吡非尼酮通过抑制TGF-β1，一定程度上控制了成纤维细胞的增殖和迁移，减少细胞外基质如胶原蛋白的沉积，从而达到延缓患者肺纤维化程度[16]。在本研究中，SW+PFN组TGF-β1水平显著低于SW组，提示吡非尼酮可能通过抑制TGF-β1水平，从而降低了成纤维细胞的增殖和胶原蛋白的合成，最终抑制了瘢痕的过度增生。

综上所述，本研究发现，吡非尼酮能有效地抑制实验动物海水浸泡膝关节创伤后瘢痕增生，且可能是通过抑制TGF-β1的表达，从而调控了胶原合成与降解，缓解了瘢痕的过度增生。因此，吡非尼酮可能成为治疗海水浸泡膝关节创伤的药物，具有一定的应用潜力。然而，本实验仍存在一些不足之处。首先，海水具有低温、偏碱性、高渗透压及致病菌多等特点[17]，伤口继发的病理生理学变化往往比陆地损伤更为复杂，难于控制，本实验尚属初步探索，真实海水浸泡环境的模拟和重现在进一步研究中尤为重要。其次，目前学者们大多采用兔制备膝关节创伤后粘连动物模型[18]，侧重于术后并发症的治疗；海水浸泡膝关节损伤少见于报道，诊断标准仍不明确，加之致伤混杂因素繁多，至今并无公认成熟的海水浸泡膝关节损伤动物模型供研究使用。因此，需要不断深入研究来获取更完善的数据指标，从而建立适宜的动物损伤模型以利于进一步的实验探索。