评定超高效液相色谱法测定山桐子油中苯并(a)芘(BaP)的不确定度*

单晓雪 姜 涛 张宇冲 廖子龙 杨 娟 刘晓莉

(中储粮成都储藏研究院有限公司 610081)

苯并(a)芘(BaP)是苯与芘稠合而成的一类多环芳烃，具有明显致癌作用[1～2]。它在环境中存在广泛，以食用油为例，BaP主要来自外环境污染和加工过程高温烘烤、压榨[3～4]。近年来，我国已将植物油列入食品安全监督抽查和风险监测的重点监控食品。针对BaP的检测引入不确定度，对于质量控制有着重要的意义[5]。检测结果的不确定度可以反映被测量值的分散性，置信度区间的半宽度[6]。本文针对BaP的检测结果进行不确定度的评定和计算[7～9]，为评价测量结果质量提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

实验用的山桐子油样品为本实验室某次检验余样；BaP标准品纯度大于等于98%；BaP分子印迹柱；乙腈色谱级，正己烷色谱级；二氯甲烷分析纯；超高效液相色谱仪1290配FID检测器；旋蒸仪；纯水仪；电子天平。

1.2 实验方法

本实验参照国标《食品安全国家标准 食品中苯并(a)芘的测定》(GB5009.27-2016)的要求，对试样中BaP的含量进行测定。

1.2.1 样品处理 用5 mL正己烷对试样进行溶解，涡旋混合0.5 min，全部加入已经活化好的印迹小柱里，移取6 mL正己烷淋洗柱子，弃去流出液，再用10 mL二氯甲烷洗脱并收集净化液，40℃旋蒸至净干，最后准确移取乙腈5 mL复溶，过0.15 μm的滤膜，装瓶上机待测。根据标准曲线计算样品中BaP的含量。

1.2.2 标液的配置 称取BaP标品11.2 mg，用乙腈配置成11.2 μg/mL的贮备液，再逐级稀释到浓度为0.56 ng/mL，1.12 ng/mL，5.60 ng/mL，11.2 ng/mL，22.4 ng/mL五个梯度的标准使用液。

1.2.3 色谱条件 流动相为乙腈∶水=90∶10；北京Dikmatech C18色谱柱(Endeavorsil 1.8 μm.2.1 μm×50 mm)，流速：0.350 mL/min；柱温：30℃；进样体积：5 μL；检测器：FID，激发波长384 nm，发射波长406 nm。

2 数学建模和不确定度来源分析

2.1 建立数学模型

BaP含量计算按照标准曲线法计算，结果以μg/kg表示，保留小数点后一位，其数学模型为

式中:X为试样中BaP的含量(μg/kg)；ρ为从标准曲线得到的样品待测液的浓度(ng/mL)；V试样最终定容体积(mL)；m为秤样质量(g)；

2.2 BaP含量不确定度的来源分析

对整个实验过程和数学模型分析，不确定度来源主要有以下几个方面：(1)样品前处理产生的不确定度；(2)标准溶液配制产生的不确定度；(3)标准曲线引入的不确定度；(4)样品重复性实验产生的不确定度；(5)样品回收率产生的不确定度。

3 不确定度分量的评定

3.1 样品前处理产生的不确定度

样品前处理中不确定度来源于称量、移液、定容。

3.1.2 样液移液和定容引起的不确定度 实验中需要用移液管准确移取5 mL乙腈定容上机,该移液管重复移取10次的标准偏差为4.22×10-3。量具检定的实际容量偏差分为0.022 mL，因移取的试剂的不同，采用对应试剂的膨胀系数，在实验室温度20℃±5℃下，进行校准，乙腈膨胀系数为1.37×10-3(1/℃)，数据见表1。

表1 样液使用1次的移取和定容引起的不确定度

3.2 标准溶液配制产生的不确定度

标准溶液配制产生的不确定度主要来源于标准物质的纯度，标准物质的称量，标液的配置三个方面。

表2 标液移取和定容引起的不确定度

3.3 标准曲线引入的不确定度

对每个浓度的标准使用液进行6次重复进样检测，峰面积及其平均值数据见表3，采用最小二乘对每个浓度峰面积的平均值与浓度进行拟合，得到拟合方程Y=21.911X-3.5508，R2=0.99969(式中，Y为峰面积，X为BaP浓度，b=21.911为拟合曲线斜率，a=3.5508为拟合曲线截距)。

表3 每个浓度的标准使用液六次重复进样的峰面积

拟合曲线求样品溶液中BaP平均浓度C产生的标准不确定度公式为：

式中：s(A)——标准曲线残余偏差为：

C0——样品溶液的平均质量浓度11.9124 ng/mL；

Xi——对应第i标液的拟合浓度ng/mL；

N——样品平行测定次数，N=6；

n——标准溶液测定次数，n=5×6=30；

b——为拟合曲线斜率；

3.4 提取效率因素引入的相对标准不确定度

3.4.1 样品检测重复性因素引起的不确定度 重复称量6次样品，在同一条件下进行检测，得到的结果见表4。

表4 样品6次重复测定结果

运用spss22.0，用数据对比检测平均值进行显著性检验，sig.(2-tailed)值为0.929，>0.05，说明6次结果与平均值无明显差异，故采用A方法评定，重复性相对不确定度为

3.4.2 加标回收引起的不确定度 重复称量6次样品，根据之前测定的样品本底含量，做加标回收，结果见表5。

表5 样品加标回收测定结果

由于样本量少，运用spss22.0，对平均回收率进行显著性检验，sig.(2-tailed)值为0.994，>0.05，说明回收率与均值之间没有显著性差异，可以不必带入回收校正因子，故采用A方法评定，回收率的相对不确定度为：

4 测量不确定度的评定

4.1 合成标准不确定度

根据上诉不确定度分量的分析，合成不确定度Urel(X)的公式如下：

合成标准不确定度和各分量不确定度占比见表6。

表6 合成标准不确定度和各分量不确定度占比

4.2 相对扩展不确定度评价

取包含因子k=2，置信概率为95%，则高效液相色谱法测量BaP的相对不确定度为Urel=K×Urel(X)=2×0.0466=0.0932。

4.3 扩展不确定度

5 结论与讨论

本文对超高效液相色谱法测定，运用标准曲线法计算山桐子油中BaP含量，对影响测量结果的不确定度来源进行分析，并对其不确定度进行评定。综上得出，桐子油样品中BaP含量测定结果X=(39.1±3.6)μg/kg，k=2。影响BaP测定结果的因素主要是是标准曲线占比47.99%，其后依次为标准溶液配置占比20.67%，方法重复性占比8.85%，方法回收率占比8.58%，标准品称量占比6.29%，样品前处理占比5.50%，标准品纯度和样品称量带来的不确定度占比最小，分别为1.75%和0.37%，这和众多相关不确定度研究结果类似[10～12]。要降低不确定度，就要从标准曲线绘制，严格规范标液配制操作开始。标液要保存得当，定期核查。上机过程中仪器是否稳定，样品前处理时人员操作水平是否一致，操作是否规范，目标物质提取是否达充分，都是影响方法重复性和回收率的因素[13]。故实验室中的仪器检定、期间核查和人员比对就显得尤为重要。实验室的精确仪器如容量瓶、移液管等，也应定期校准和检定。标品在采购时，纯度示值和不确定度应该值得关注，把控好标品的存放条件可以降低标品纯度的不确定度。称量仪器如不同量程的天平除了定期检定，日常的清理和维护也是保持其精密度的措施之一。