钝叶草叶斑病病原鉴定

郑金龙 刘文波 贺春萍 易克贤 习金根 粱艳琼 Gbokie Jr Thomas 吴杨

摘  要：為鉴定钝叶草叶斑病的病原，通过对61份来自中国海南、广东、广西、云南、福建、江苏，以及美国和南非的疑似钝叶草叶斑病的叶片样品进行分离培养，获得120个菌株，对其进行纯化培养、形态学观察、致病性测定，利用来自海南的钝叶草为靶标寄主，并利用rDNA-ITS、GAPDH、TUB2引物对55号菌株进行分析鉴定。结果表明，经柯赫氏法则验证40株菌株不致病，70株致病性较弱，10株致病性强;选择55号致病性强菌株，进行形态观察，初步确定该病的病原菌为新月弯孢霉（Culvularia lunata），经3种引物的PCR扩增测序鉴定，和C. lunata相似性达到99%，进一步确定钝叶草叶斑病的致病菌为新月弯孢霉。研究结果将为今后对钝叶草叶斑病的发病规律、防治方法及抗病机制等方面的研究提供理论依据。

关键词：钝叶草;叶斑病;新月弯孢菌;病原菌鉴定;致病性测定

中图分类号：S436.8      文献标识码：A

Identification of the Pathogen of Stenotaphrum helferi Leaf Spot

ZHENG Jinlong1， LIU Wenbo2*， HE Chunping1， YI Kexian1*， XI Jingen1， LIANG Yanqiong1， Gbokie Jr Thomas3， WU Yang4

1. Environment and Plant Protection Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory of Integrated Pest Management on Tropical Crops， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Haikou， Hainan 571101， China; 2. College of Plant Protection， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China; 3. College of Plant Protection， Nanjing Agricultural University， Nanjing， Jiangsu 210095， China; 4. School of Life Sciences， Jinggangshan University， Jian， Jiangxi 343009， China

Abstract： This study aimed to identify the pathogen of the leaf spot of Stenotaphrum helferi. A total of 61 leaf samples of S. helferi with suspected leaf spot disease were collected from six provinces in China （Hainan， Guangdong， Guangxi， Yunnan， Fujian and Jiangsu）， the United States and the South Africa. The potential causal agents were isolated and 120 bacterial strains were obtained. The strains were identified in morphology， and by conducting pathogenicity assay in the accesions from Hainan. In addition， the strains were identified by the PCR method based on the rDNA internal transcribed spacer region （rDNA-ITS）， glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase （GAPDH） and β-tubulin （TUB2） sequences. The analysis followed Koch's law and showed 40 strains with no pathogenisis， 70 strains with weak pathogenisis， and 10 strains with strong pathogenisis. The strains of No.55 with strong pathogenisis were selected for morphological observation， and the pathogens of the disease were preliminarily determined. Sequence identities of rDNA-ITS， GAPDH and TUB2 between No.55 strains and Curvularia lunata reached 99%， suggesting that the pathogenic bacteria of the leaf spot in S. helferi was C. lunata. Our findings would provide data to support future studies on the epidemiology， resistance mechanism and control strategy of the leaf spot disease of bluestocked grass.

Keywords： Stenotaphrum helferi; leaf spot; Curvularia lunata; pathogen identification; pathogenicity assay

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.04.026

钝叶草（Stenotaphrum helferi）为禾本科（Gramineae）钝叶草属（Stenotaphrum）的多年生草本植物，是一种新型、优良的暖季型草坪草。因其抗寒性较差[1]，适宜在热带与亚热带气候条件下生长[2]，除具有耐阴性强[3]、抗旱性好[4]，具有一定的抗病性[5-6]，土壤适应性强、再生力强的生物学特性，还有耐践踏、绿期较长、耐淹湿[7]等优良性状，适合用于城市的高架桥，疏林地带的绿化植被，也可以用做草坪草[8]。

据文献报道，钝叶草病害约15种，病原菌约36种[5]，主要包括尾孢菌叶斑病（Cercospora festucae Hardison）、币斑病（Sclerotinia homoeocarpa F. T. Bennett）、霜霉病（Sclerospora macrospora Sacc.）、蘑菇圈（Agaricals）、灰斑病（Pyricularia grisea Sacc.）[9-12]、丝核菌叶斑病（Rhizoctoria oryzae Ryk. et Gooch）[13]、散黑粉病（Ustilago affinis Ell. & Ev.）[11]、黑孢枯萎病（Nigrospora sphaerica Mason）[11]、褐曲病（Rhizoctonia solani Kuhn）[10， 11， 13]、根腐病（Gaeumannomyces graminis Var.graminis Arx. & D. Oliver）[14]、銹病（Puccinia stenotaphri）[9-11]、叶鞘腐烂病（Rhizoctoria oryzae Ryk. et Gooch）[13]、粘菌病（Fuligo spp.）[13]、钝叶草衰退病（Panicum mosaic virus）[10-11]等。其中已报道在我国福建的花斑钝叶草上发生比较普遍的是尾孢菌叶斑病[15]。但由新月弯孢霉（Curvularia lunata）引起的钝叶草叶斑病在我国尚未见报道。

新月弯孢菌属无性型真菌弯孢霉属，其有性态为新月旋孢腔菌（Cochliobolus lunata Nelson & Haasis），属于子囊菌门旋孢腔菌属真菌（Cochliobolus），二者是异源的[16]。新月弯孢菌（Curvularia lunata，有性态Cochliobolus lunata）是一种常见的植物病原菌，其寄生兼营腐生，该菌可以侵染水稻、玉米、辣椒、香蕉、番茄、高粱、唐菖蒲等多种作物[17]，引起玉米叶斑病、高粱叶枯病、大麻叶斑病、甘蔗幼苗枯萎病等[18]，该菌甚至对人体也有致病性，可引起真菌性角膜炎、足菌肿和腹膜炎等疾病[19]，是少见的条件致病菌。由新月弯孢菌引起的钝叶草叶斑病是钝叶草生产上最为严重的病害之一，多从叶轴发病，引起叶片大面积枯萎，重则致其枯死。本研究通过病原菌分离纯化、形态学观察、致病性测定和分子生物学鉴定等手段对61份钝叶草品种（系）的叶斑病进行病原鉴定，以期为该病害的综合防治提供理论依据。

1  材料与方法

1.1  材料

61份钝叶草材料收集自中国的海南、福建、广西、广东、江苏、云南，以及美国和南非等不同原产地（表1），种质资源种植在海南大学热带农林学院实验基地。每份材料采1份共采取61份疑似钝叶草叶斑病病叶作为实验材料。

1.2  方法

1.2.1  致病菌分离纯化  采用常规组织分离法从叶片病斑处分离病原菌[20]，后切取大小约4～5 mm的组织块，用75%的乙醇浸30 s，0.1%升汞表面消毒2～3 min，然后用无菌水冲洗3次，之后将其分别转移到马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基上。放置于28 ℃全光照恒温培养箱内培养，观察并记录病原菌的生长情况。

1.2.2  致病性测定  （1）损伤接种测定。选取分离的病原菌，用液体培养基培养摇菌，使孢子浓度为107个/mL。从田间采集61份健康、大小均一的钝叶草植株，每株含12～14片健康新鲜的叶片。将叶片放置于保鲜盒进行刺伤接种，每片叶接种1处（具体操作：摇匀病菌，用移液器移50 μL孢子悬浮液于叶片刺伤处），接种处以薄脱脂棉保湿，然后全部用油纸袋封好做保湿处理，7 d后观察并记录发病情况。

（2）非损伤接种测定。选取分离的病原菌，用液体培养基培养摇菌，使孢子浓度为107个/mL。从田间采集61份健康、大小均一的钝叶草植株，每株含12～14片健康新鲜叶片。将其放置在三角瓶中进行扦插水培，待恢复生长24 h后接种。将孢子悬浮液均匀喷雾于所有的叶片上，对照组喷清水。共喷2次，间隔3 d喷第2次。实验植株全部放在透明的大塑料箱中，用油纸袋封好做保湿处理，7 d后观察并记录发病情况，选取致病性最强的菌株做后续的实验。

1.2.3  病原菌形态学鉴定  将1.2.2筛选出的致病性最强的病原菌分别接种到水琼脂（WA）培养基和马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基上，经过28 ℃全光照恒温培养一段时间，待生长出菌落， 观察并记录菌落的培养性状，包括菌落的形状、颜色、气生菌丝的有无及其是否发达。

病原菌形态观察包括观察分子孢子类型、大小、形状、分隔数;孢子梗的形态、长度、宽度和颜色等。

1.2.4  病原菌分子鉴定  PCR序列扩增和测序。提取DNA后，分别利用ITS、GAPDH和TUB2基因的部分序列引物对基因组DNA进行PCR扩增，引物序列、退火温度及延伸时间等见表2。

PCR体系总体积为25 μL：0.1 μL TaqDNA聚合酶（5U/μL）;2.5 μL Loading buffer（含Mg2+）;2 μL dNTPs;1 μL引物（10 μmol/L）;2 μL模板DNA，用灭菌ddH2O补足25 μL。后用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，拍照记录，并采用凝胶成像系统分析片段的大小，目的片段经回收送往深圳华大基因科技有限公司进行测序。

病原菌rDNA～ITS序列同源性比较。在NCBI数据库检索测序所得的基因部分序列后，得到序列号分别为：引物ITS对应系列号为HF934911，引物GAPDH对应系列号为MG018252，引物TUB2对应系列号为KT021349。经过MEGA 6.0软件的“W”功能比对校正后，用Bootstrap test构建系统进化树，并采用Neighbor joining法计算遗传距离。同时对病原菌分别进行ITS、TUB2和GAPDH单基因聚类分析，并将基因按照ITS～ GAPDH～TUB2的顺序进行序列拼接后重新采用上述方法构建系统进化树，以进一步分析确定该病原菌。

2  结果与分析

2.1  病害症状

新月弯孢霉钝叶草叶斑病是一种真菌病害，发病初期，病部出现半透明小斑点，呈淡黄色或水渍状;随后，病斑逐渐扩大，在病叶产生沿叶轴平行伸长的深褐色、边缘褪绿的椭圆形或不规则病斑;发病后期，病斑中央呈黄褐色或灰白色，且产生一些黑色小粒点，环境潮湿时发病严重，产生灰白色霉层和大量分生孢子（图1），重则整叶枯黄至死亡。

2.2  病原菌分离和致病力测定

共分离获得120份菌株，通过损伤接种和非损伤接种2种方法分别对这些分离菌株进行病原菌致病力测定，经观察，结果表明，2种接种方法均能使叶片发病，且症状与初始分离所选的叶片病症相同（图1），发病症状和发病时间无明显区别。以接种后发病叶片作为分离材料再次进行分离，重复接种后，所得病原菌与初次分离所得菌落在分生孢子形态等方面相同（图1），符合柯赫氏法则。经柯赫氏法则验证，40株菌株不致病，70株致病较弱，10株致病性强，其中55号菌株经2种方法接种，其发病面积最大，说明其致病性最强。

2.3  病原菌形态特征

病原菌在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基上28 ℃全光照恒温培养4 d后菌落直径超过5 cm，7 d后长满培养基，直径约为9 cm。菌丝体呈绒毛状，初始为白色，后随着培养时间增加，由中央向边缘部位渐变为底部灰黑色，上面布满灰白色绒毛状菌丝;培养基背面在第3天起中部呈灰黑色，近边缘处呈黄色，后期全部变为蓝黑色。分生孢子呈淡褐色，梭形，具3个隔膜，由基部向上第3个细胞较大;分生孢子梗呈深褐色，有横膈，顶端多弯曲（图2）。分生孢子测量大小为（19.39～37.45）μm×（7.78～15.80）μm，分生孢子梗测量大小为（40.41～224.92）μm×（3.84～7.69）μm。通过以上对培养性状和形态学的观察，并进行相关资料的查阅[21-23]，可初步鉴定引起该病害的病原菌为弯孢霉属（Curvularia sp.）新月弯孢霉（C. lunata）。

2.4  病原菌的分子鉴定

分别利用ITS、GAPDH和TUB2基因的部分序列引物对55号菌株基因组DNA进行PCR扩增，后用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物（图3）。目的片段经回收测序后，应用核酸数据库中的BLAST软件，在DNA序列数据库中检索出同源DNA序列并比较分析。根据与其亲缘关系较近的DNA序列进行比对，显示均为新月弯孢菌基因组。根据ITS、TUB2和GAPDH部分序列分别做聚类分析，然后根据ITS～GAPDH～TUB2这3个基因序列拼接后聚类（图4）。结果与各单基因分析类似，进一步表明可以将該病原菌归属于新月弯孢霉属。

3  讨论

钝叶草叶斑病是目前钝叶草生产上的最主要病害之一，特别是海南高温高湿的气候环境，更有利于该病的暴发流行。本研究从61份疑似钝叶草叶斑病的叶片中分离到120个菌株，通过形态观察，并经文献比对[21-23]，确定均为弯孢属。但是绝大部分菌株不致病或致病性较弱，只有少部分比较强，这可能与弯孢菌为弱寄生而又能腐生的习性有关，这与金敏忠等[17]的研究结果一致。另外，实验只选取来自海南的钝叶草叶片为靶标，可能其他的钝叶草属对该病原菌具有抗性，这有待于后期的研究进一步验证。

国外对弯孢霉的研究较早，马丁于1936年报道了由C. lunata严重侵染水稻引起的谷粒变色[24]。1956年，Nelson等[25]报道了玉米弯孢霉叶斑病的发生，此后，Mandokhot[26]、Macrì[27]及Gao等[28]在20多个国家也相继报道了该病[29]。我国对弯孢霉的研究起步较晚，1972年出版的《中国真菌总汇》中报道了5种弯孢菌[30]，1979年出版的《真菌鉴定手册》报道了4个种[31]，张猛等[32-34]从形态分类与RAPD技术相结合的方式解决了弯孢属种间的分类。近年来，在Plant Disease上关于病原物为弯孢属的报道较多，Chen等[35]首次报道了郁金香叶斑病病原棒弯孢（Curvularia clavata），Bagwari等[36]也报道了由画眉草弯孢霉（C. eragrostidis）引起的杨树叶片叶斑病，但未见弯孢霉侵染钝叶草的报道。

本研究仅对钝叶草叶斑病病原菌进行形态学观察、致病性测定和分子生物学鉴定，明确了该病的病原菌为新月弯孢霉（C. lunata），这对于该病害的防治具有指导意义。但由于新月弯孢霉一年四季均可侵染钝叶草引发叶斑病，病原菌不需要越冬，而且由于南方地区高温高湿的环境特征，导致该病易发、频发，因此，防治钝叶草叶斑病除了选用低毒高效的杀菌剂外，还需加强人工栽培管理措施，尽可能减少植株机械伤口，以减少病原菌侵入，达到钝叶草作为一种新型草坪草的最佳利用效果。

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责任编辑：谢龙莲