利用流式细胞术对29份火龙果种质染色体的倍性鉴定

黄黎芳 武志江 梁桂东 陆贵锋 黄凤珠 刘朝安 邓海燕

摘  要：火龙果为仙人掌科量天尺属和蛇鞭柱属植物，不同类型火龙果种质的染色体倍性尚不明确。为明确所收集的种质资源以及创制的新材料的染色体倍性，利用流式细胞技术对29份火龙果材料进行了倍性鉴定。结果显示，供试的18份种质资源中共鉴定出二倍体火龙果14份，四倍体4份，无三倍体材料。通过不同倍性亲本杂交和秋水仙素诱变所创制的8份后代材料经鉴定发现有二倍体材料1份，三倍体材料3份，四倍体材料4份，这表明火龙果属间杂交和化学诱变可获得多倍体材料。研究结果对火龙果资源的遗传学评价以及开展倍性杂交育种提供重要的参考依据。

关键词：流式细胞术;火龙果;种质资源;染色体;倍性分析中图分类号：S667      文献标识码：A

Ploidy Determination of 29 Pitaya Germplasms Using Flow Cytometry

HUANG Lifang， WU Zhijiang， LIANG Guidong， LU Guifeng， HUANG Fengzhu， LIU Chaoan，DENG Haiyan^*

Horticultural Research Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning， Guangxi 530007， China

Abstract： Pitaya which belongs to the cactus family includes two genus，HylocereusandSeleniereus， the ploidy levels of different pitaya germplasms are still not clear. In order to clarify the ploidy of germplasm resources and the hybrids or mutants， the ploidy of 29 pitaya materials were identified by flow cytometry. 14 of 18 germplasm materials were diploid and others were tetraploid while no triploids were available. The 8 interploid hybrids and colchicine-induced mutants were identified as 3 triploids， 4 tetraploids and 1 diploid， which showed that polyploid materials could be obtained by intergeneric hybridization and chemical mutagenesis of pitaya. The results would provide an important reference basis for genetic evaluation and ploidy cross breeding of pitaya resources.

Keywords： flow cytometry; pitaya; germplasm resources; chromosome; ploidy analysis

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.04.008

火龙果为仙人掌科（Cactaceae）量天尺属（Hylocereus）和蛇鞭柱属（Seleniereus）攀援性多年生植物，原产于中南美洲热带地区，因其果实丰富的营养价值和功能作用广受消费者欢迎。自20世纪90年代引入中国大陆以来，在我国南亚热带地区广泛种植。火龙果种质资源丰富，在自然界中主要存在二倍体（2n=22）和四倍体（2n=44）2种类型^[1-2]。Tel-Zur等^[3]报道了火龙果量天尺属为二倍体（2n=22），蛇鞭柱属也是二倍体（2n=22），有刺黄皮白肉种Hylocereus megalanthus属于异源四倍体（2n=4x=44），来源于Hylocereus和Seleniereus属的自然杂交。刘顺枝等^[4-5]利用优化的染色体制片技术开展了火龙果植物染色体观察研究，并进行了染色体核型分析，发现白肉火龙果（Hylocereus undatus）的染色体数目为2n=2x=22，红肉火龙果（Hylocereus polyrhizus）染色体数目为2n=2x=22。因火龙果植物包含2个属以及其属间杂交种，通过种质资源收集得到的除原生种外，还有许多育种中间材料，其倍性类型不明确。不同倍体间杂交是火龙果育种经常采用的方法之一，这使得杂交后代植株的倍性水平复杂多样，因此鉴别火龙果种质资源及创制的后代植株的倍性，在火龙果育种实践中非常必要。

染色体计数法和染色体核型分析可以精确鉴定火龙果倍性，但其操作耗时，不适宜大规模鉴定倍性。流式细胞术（flow cytometry，FCM）是利用流式细胞仪进行分析、分选的技术，采用光学系统对高速流动的单细胞悬浮液进行多参数测量和信号处理得到的DNA含量分布曲线，可以直接观测植物倍性。近年来，流式细胞仪检测已广泛应用于细胞学、遗传學、细胞周期分析及植物基因组大小估算等研究中。迄今在苹果^[6]、猕猴桃^[7]、草莓^[8]、越橘^[9]、梨^[10]和荔枝^[11]等果树上均证实了流式细胞光度术鉴定植株染色体倍性的可靠性。本研究利用流式细胞技术对收集的火龙果不同种质资源类型和创制的后代植株进行染色体倍性鉴定研究，以期挖掘更多的多倍体种质，为火龙果种质资源的创新和开发利用提供参考。

1  材料与方法

1.1 材料

1.1.1  供试种质  供试样品共29个（表1），采集于农业农村部南宁火龙果种质资源圃。材料来源于中国台湾、越南、中美洲等火龙果种植地区。试验于2019年11月采集植株的幼嫩肉质茎尖供染色体倍性分析。

1.1.2  试剂  （1）解离缓冲液（Tris·MgCl₂ 缓冲液）：200 mmol/L Tris，4 mmol/L MgCl₂，0.5%（V/V）TritionX-100;用1 mol/L HCl调节pH至7.5，0.22 mm滤膜过滤除菌，4 ℃保存。（2）染色缓冲液：解离液缓冲液中加入20 mg/L碘化丙啶（PI）和20 mg/L的RNA酶，现配现用。

1.1.3  仪器与设备  流式细胞仪型号为美国BD（Becton， Dickinson and Company）公司生产的BD660517 C6-Plus。染色体含量的分布图像由流式细胞仪自动测定，相关参数的调控参照仪器说明。光源由波长为488 nm氩离子激发，染色的DNA分子促发荧光，测定其荧光强度，与测定装置相连的计算机分析软件即可对荧光强度进行分析。本次实验所有测试样品的细胞核DNA含量是以二倍体对照为标准的相对值，每次检测至少收集5000个细胞颗粒。

1.2方法

（1）稱取约50 mg的叶片组织，蒸馏水洗净表面尘土，滤纸吸干后放入预冷的培养皿内，加预冷的解离液1 mL解离缓冲液;用锋利的刀片一次性快速切碎，整个过程材料需浸没在解离液中，以便更好地游离细胞核。（2）吸取培养皿内的解离液，用300目的滤膜过滤至1.5 mL离心管中，15 000 r/min离心15～20 s，弃上清。（3）加200 μL预冷的染色缓冲液重悬，37 ℃孵育15 min，上机检测。

2  结果与分析

2.1流式细胞倍性检测

以二倍体红皮红肉火龙果‘金都1号为对照，流式细胞仪测得二倍体品种染色体的峰值荧光强度为187×10³，表现为较好的单峰;三倍体品种DNA相对含量是二倍体的1.5倍，呈现为1.5倍二倍体的单峰;四倍体品种染色体相对含量是二倍体的2倍，呈现为2倍二倍体的单峰（图1）。

2.2不同类型火龙果种质资源的染色体倍性

经流式细胞仪检测收集的18份不同类型的火龙果种质材料染色体倍性，从表2可见，其中量天尺属红皮白肉品种‘越南白肉、青皮白肉品种‘青龙和无刺黄皮白肉品种‘无刺黄龙均鉴定为二倍体，与对照‘霸王花倍性一致。鉴定发现4份四倍体种质材料分别为‘哥伦比亚黄龙‘燕窝果‘美国糖龙‘红麒麟。其中‘燕窝果来源于‘哥伦比亚黄龙后代，表现出四倍体的特征;‘美国糖龙和‘红麒麟为量天尺属红皮红肉品种二倍体与‘哥伦比亚黄龙四倍体的杂交后代，也表现出四倍体的特征。其余7个量天尺属红皮红肉品种经鉴定均为二倍体。蛇鞭柱属的‘黑龙和属间杂交种‘白水晶‘红肉燕窝果‘小叶红水晶经鉴定为二倍体材料。未发现有三倍体种质材料。

2.3 杂交后代及诱变材料的染色体倍性水平

本课题组前期利用2个S. megalanthus种质A13（4x）和C59（4x）分别与H. undatus种质MB（2x）杂交，获得后代A13-MB、C59-MB1和C59-MB2。经流式细胞术检测A13-MB为四倍体，C59-MB1和C59-MB2为三倍体植株（表3），说明火龙果四倍体与二倍体属间杂交可产生一定比例的三倍体和四倍体。而C59自交产生的F₁代植株C59+经鉴定为四倍体，该结果与四倍体自交后代倍性预期一致。育种中间材料C51经鉴定为三倍体，三倍体C51与二倍体MB杂交F₁代未发现多倍体，仅产生二倍体后代C51-MB。流式细胞仪测得的三倍体和四倍体材料结果基本符合预期。

YD-1、YD-2为本课题组前期利用二倍体材料H. polyrhizus种子经秋水仙素加倍后产生的诱变植株，其细胞核DNA含量直方图上出现单一的波峰，且其峰荧光值与对照相差近一倍，说明二者染色体数目加倍，其植株倍性预测为四倍体。前期形态学观察也表现出子叶显著增大增厚，植株健壮，生长势强等特征。诱变植株未发现存在细胞核含量成倍数性差异的两群细胞，说明无倍性嵌合体出现。

3  讨论

通过形态学鉴定植株倍性，是早期研究者最常用的方法。火龙果四倍体材料是异源四倍体，在植株形态上与其他二倍体植株有较大差异，但仅通过形态学观察不能精准判断火龙果的倍性，尤其在幼苗期，不同倍性材料形态学差异并不显著。利用流式细胞术能在幼苗期鉴定植株倍性，将为高效准确筛选杂交育种材料提供便利。本研究中，测试的18份种质资源仅‘越南白肉经刘顺枝等^[4]利用染色体制片法鉴定为二倍体，‘哥伦比亚黄龙经Tel-Zur等^[12]利用流式细胞术鉴定为四倍体，其余16份材料均为本研究首次分析确定其染色体倍性。经测试，‘越南白肉和‘哥伦比亚黄龙染色体倍性与前人报道一致。其余16份种质资源按不同种属类型，其倍性鉴定结果与Tel-Zur等^[12]报道的相应类型的材料倍性一致，量天尺属的红皮白肉、青皮白肉和无刺黄皮白肉品种均被认为是二倍体，而量天尺属的红皮红肉、蛇鞭柱属的红皮红肉和红皮白肉种也均为二倍体。而形态学上与S. megalanrus具有类似特征的带刺黄皮白肉及其后代、带刺橘皮红肉品种均为四倍体。18份种质资源材料中未检测到三倍体植株，可能火龙果天然杂交出现三倍体的几率较低。

火龙果的刺黄皮白肉四倍体种H. megalanrus既具有量天尺属类似的三棱柱状肉质茎，又像蛇鞭柱属一般具有带刺的果实，果实具有浓郁的风味，被用于培育优良的多倍体杂交种，以期获得具更优良性状如更大的果实、果皮不带刺和更高的产量的品种。根据这些育种目标，研究人员进行了属间杂交和化学诱变等多倍体育种，可产生性状改良的二倍体和多倍体后代应用于育种实践中^[13]。本研究应用流式细胞仪测定的11个杂交亲本和后代以及诱变植株中，亲本A13和C59为四倍体，MB为二倍体;创制的种质中发现1个二倍体C51-MB;3个三倍体分别是C59-MB1、C59-MB2、C51;4个四倍体分别是A13-MB、C59+、YD-1、YD-2;倍性突变材料未见有二倍体和四倍体的嵌合体或混倍体出现。本研究中Hylocereus和Seleniereus的属间杂交可获得一定比例的二倍体、三倍体和四倍体，但未像前人报道一样获得五倍体和六倍体^[14]，可能与本试验所用杂交后代材料较少有关。而三倍体C51作为母本经与二倍体父本MB（H. undatus）杂交得出二倍体后代C51-MB，说明该三倍体是部分可育的，至少可产生具有功能的雌配子，在与花粉供体杂交的情况下最终形成可存活的后代。Tel-Zur等^[15]推测异源三倍体产生功能性雌雄配子的比例较高是由于染色体平衡分离的结果。本试验仅停留在对火龙果植物进行染色体倍性鉴定上，而基于火龙果植物细胞学方面的研究较少，下一步将继续开展火龙果多倍体的核型分析、气孔大小和密度、可育性等方面研究，为火龙果育种提供更多细胞学支撑。

另外，本研究发现同一倍性内不同品种火龙果细胞核DNA含量差异不显著，倍性间细胞核DNA含量成倍数性差异，进一步证明利用流式细胞光度术测定细胞核DNA相对含量来鉴定火龙果倍性是可行的。與利用染色体计数法相比，流式细胞光度术测定核DNA含量试样处理简单，试材用量小（50 mg左右），测量较准确、快速、重复性好，适用于样本较多的植物倍性检测分析，对于多倍体后代的早期鉴定具有较大应用价值，但是缺陷是不能获得更为详细的染色体信息。

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责任编辑：沈德发