牛骨胶原水解物抑制鲢鱼肌原纤维蛋白氧化和增强凝胶特性研究

王 鹏，穆雅慧，何思宁，马松艳，马 雪，张雅娜，郭 丽

（绥化学院食品与制药工程学院，黑龙江绥化 152061）

2018年我国水产加工品总量为634.879万吨，其中鱼糜制品为145.546万吨，占水产加工品产量的22.92%[1]。随着全球海水鱼类的总体减产，内陆淡水鱼类养殖的持续增长，淡水鱼类成为鱼糜生产最有潜力的原料。鲢鱼（Hypophthalmichthys molitrix）养殖产量大，价格低，肉质鲜嫩，是生产鱼糜等加工制品的常用蛋白质资源。淡水鱼在加工和贮藏过程中，易发生蛋白质变性；同时与传统的海水鱼类相比，淡水鱼凝胶形成能力弱，因此需要添加外源物质减少蛋白质氧化降解，增强其凝胶品质[2−3]。大量研究报道表明，鱼骨粉及其蛋白水解物具有功能活性，可提高鱼肌原纤维蛋白凝胶强度。3%鳕鱼鱼骨粉可提高海鲈鱼肌原纤维蛋白凝胶持水性和凝胶强度[4]，纳米鱼骨能够增强鲢鱼肌球蛋白的凝胶性能[5]，骨蛋白水解物能够抑制鲤鱼鱼糜的蛋白和脂肪氧化变性，浓度越高效果越明显[6]。用胰蛋白酶和碱性蛋白酶制备的鱼糜加工副产物水解物，具有抗氧化活性，添加到鱼糜中，可阻止巯基氧化、羰基化、肌球蛋白变性，可明显改善凝胶性质和保水能力[7]。

牛骨是牛肉加工过程中产生的主要副产品之一，通常被用于生产骨粉、骨泥、饲料等低价值商品[8]，牛骨中含有约14%～23%的胶原蛋白[9]，胶原蛋白经酶解后可获得具有高附加值的水解产物。Gao等[10]发现牛骨胶原水解物对小鼠具有免疫调节作用。张顺亮等[11]利用中性蛋白酶酶解、超滤分离获得小于10 kDa分子质量的牛骨胶原蛋白水解物，在20 mg/mL的浓度下对大肠杆菌抑菌率为93.61%。Ku等[12]研究发现，牛骨胶原蛋白肽具有较强的抗氧化能力，对DPPH自由基清除率高达72.81%。因此，酶解牛骨蛋白是优化利用骨蛋白的途径之一，而牛骨蛋白酶解物也可作为肉类制品有效的天然抗氧化剂。目前关于骨蛋白酶解物在鱼肌原纤维蛋白应用研究较多的来自鱼骨和猪骨[6−7]，未见关于牛骨胶原水解物在淡水鱼凝胶食品中应用的报道。

本研究选择胃蛋白酶和胰蛋白酶制备牛骨胶原水解物，综合评价添加不同浓度牛骨胶原水解物对鲢鱼肌原纤维蛋白凝胶品质及抗氧化活性的影响，以期为牛骨高附加值产品在鱼糜制品中的工业应用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

牛骨、鲜活鲢鱼 大润发超市；胃蛋白酶（300000 U/g） 上海源叶生物科技有限公司；胰蛋白酶（250000 U/g） 北京奥博星生物技术责任有限公司；8-苯氨基-1-萘磺酸铵盐（ANS） 深圳市美凯特科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）南京奥多福尼生物科技有限公司；2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS） 北京酷尔化学科技有限公司。

TYAIB高压蒸汽灭菌锅 上海博讯实业有限公司医疗设备厂；FW135高速万能粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司；CR-400色差仪 日本柯尼卡美能达公司；GL-16G-II高速冷冻离心机 上海市安亭科学仪器厂；TA-XT.puls质构仪 英国Stable Micro System公司；TENSOR 27傅里叶红外光谱仪 德国BRUKER科学仪器公司；Hitachi S-3400N扫描电子显微镜 日本日立公司。

1.2 实验方法

1.2.1 牛骨胶原水解物的制备 参考代亚民[13]的方法制备牛骨胶原水解物，并略作修改。将牛股骨整理、剔膜，经121 ℃、0.1 MPa高压蒸煮3 h后，粉碎、清洗沥干。取300 g预处理后的牛骨，加入500 g 95%的正己烷，在4 ℃条件下搅拌24 h，每隔6 h更换一次95%正己烷。用蒸馏水反复洗涤，沥干后备用。将脱脂后的牛骨以料液比1:10加入0.25 mol/L的EDTA溶液（pH7.4）并在4 ℃下振摇脱钙2 d[14]。

将脱脂、脱钙后的牛骨在50 ℃下烘干，再用万能粉碎机将牛骨粉碎，过20目筛，得到牛骨粉。将牛骨粉与蒸馏水按1:6制成悬浮液，在121 ℃条件下处理3 h。然后加入胃蛋白酶以0.5%的酶/底物（w/w）比进行酶解，在pH 2.0，温度32 ℃的条件下酶解90 min。酶解后在沸水浴中灭酶15 min。冷却后，再加入胰蛋白酶以0.6%的酶/底物（w/w）比进行酶解，酶解条件为pH 7.5，温度50 ℃，酶解时间120 min。将得到的酶解液进行冷冻干燥，得到牛骨胶原水解物。

1.2.2 鲢鱼肌原纤维蛋白的制备 鲜活鲢鱼去皮、骨、内脏，取鱼背部肉200 g用组织捣碎机捣碎，加入5倍体积的0.02 mol/L pH 7.5的磷酸盐缓冲溶液搅拌均匀，肌肉匀浆液在4 ℃、4300 r/min条件下离心15 min后，弃去上清液取出沉淀，在相同条件下用上述5倍体积磷酸盐缓冲溶液洗涤所得沉淀两次，所得沉淀用5倍体积0.1 mol/L的NaCl溶液在相同的条件下洗两次，最后一次离心前抽滤，除去匀浆液中的结缔组织，得到的沉淀在4 ℃储存备用[15]。

1.2.3 牛骨胶原水解物-肌原纤维蛋白悬浮液制备取肌原纤维蛋白，加入0.02 mol/L pH 6.5的磷酸盐缓冲液（内含0.6 mol/L NaCl）溶解，配制蛋白质最终浓度为40 mg/mL的肌原纤维蛋白悬浮液。再向肌原纤维蛋白悬浮液中分别1%、2%、3%、4%、5%的牛骨胶原水解物（w/肌原纤维蛋白湿重），未添加牛骨胶原水解物为对照，在4 ℃下静置稳定12 h。

1.2.4 牛骨胶原水解物-肌原纤维蛋白凝胶制备 采用热导法进行肌原纤维蛋白凝胶制备[15]。将肌原纤维蛋白与添加五种不同浓度牛骨胶原水解物的肌原纤维蛋白，在40 ℃水浴条件下加热30 min后，再放入90 ℃水浴下加热20 min，加热完成后在冰水中冷却，最后得到肌原纤维蛋白凝胶，在4 ℃条件下平衡24 h备用。

1.3 测定方法

1.3.1 肌原纤维蛋白总巯基和活性巯基的测定 参照吴满刚[16]的方法，略有改动。取3 mL肌原纤维蛋白稀释液（4 mg/mL）加入3 mL 0.1 mol/L pH 7.0的磷酸盐缓冲溶液（内含1 mmol/L EDTA、8 mol/L尿素、1% SDS），加入0.1 mL 1%的DNTB，以不加DNTB为空白，剧烈振荡后在25 ℃水浴1 h后在离心条件为3000 r/min离心30 min。在412 nm波长下测定上清液的吸光度，计算总巯基含量。测量活性巯基含量时将反应混合液中尿素去除，其余步骤均同上，计算活性巯基含量。

式中：巯基含量单位为mol/105g，A—吸光度，N—稀释倍数，C—分子吸光系数13600 M−1·cm−1，M—肌原纤维蛋白含量，mg/mL。

1.3.2 肌原纤维蛋白表面疏水性测定 称取0.120 g ANS，用0.1 mol/L pH7.0的PBS溶解并定容至50 mL配制成ANS溶液。分别取4 mL浓度为0.8、1.6、2.4、3.2、4.0 mg/mL的蛋白液，加入20 μL预先配置的ANS溶液，振荡混匀。使用荧光分光光度计测定样品荧光强度，激发波长374 nm，发射波长485 nm。以蛋白浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标作图，计算线性回归方程曲线斜率，肌原纤维蛋白表面疏水性即用SoANS表示[17]。

1.3.3 白度的测定 经校准透明盘（L*=52.94，a*=−0.50，b*=4.85）的白度后，用手握住色差仪，将色差仪垂直放在肌原纤维蛋白凝胶表面，每测量一次后，记录好数据并用擦镜纸擦干色差仪的镜头表面，每次放置力度保持均匀，记录L*（亮度），a*（红/绿度）和b*（黄色/蓝），平行测定3次。

式中：L*—亮度，a*—红/绿度，b*—黄/蓝度。

1.3.4 保水性的测定 称取2 g肌原纤维蛋白凝胶样品放入离心管中称重，设置离心机的转数为10000 r/min，4 ℃离心3 min，倒掉离心后的水并称重量离心管和肌原纤维蛋白凝胶的重量，通过公式计算肌原纤维蛋白凝胶保水性，平行测定3次。

式中：M—离心管质量，g；M1—离心管与离心后除去水的肌原纤维蛋白凝胶总重量，g；M2—离心前离心管与肌原纤维蛋白凝胶总重量，g。

1.3.5 凝胶强度的测定 肌原纤维蛋白凝胶置于4 ℃环境中稳定12 h后，去除肌原纤维蛋白凝胶表面的液体，室温平衡10 min后进行质构分析。选用直径10 mm的圆柱状探头（P/0.5S），设定测试前速度为1 mm/s，测试中速度为0.5 mm/s，测试后速度为10 mm/s，穿刺距离为10 mm，触发力为10 g，数据速度为100（每秒钟取点数），通过软件对凝胶强度数据进行分析[18]。

1.3.6 微观结构的测定 将肌原纤维蛋白凝胶样品切成小切条（5 mm×5 mm×5 mm），用2.5%的戊二醛在4 ℃固定24 h。用0.1 mol/L pH 7.0的磷酸盐缓冲液洗涤肌原纤维蛋白凝胶条三次，以除去戊二醛流体，每次持续10 min。将除去戊二醛的肌原纤维蛋白凝胶条依次在50%、70%、80%、90%和100%乙醇中脱水10 min，重复三次。肌原纤维蛋白凝胶条用100%乙醇:叔丁醇（1:1）和叔丁醇置换15 min后，将肌原纤维蛋白凝胶条冷冻干燥36 h。使用扫描电子显微镜测定肌原纤维蛋白凝胶的微观结构[19]。

1.3.7 红外光谱分析 肌原纤维蛋白凝胶的红外光谱采用反射进行测试，取冷冻干燥后样品，加入溴化钾研磨，用压片机进行压片处理，测试400～4000 cm−1之间的透光率，观察图像峰值的变化。

1.3.8 牛骨胶原蛋白水解物-肌原纤维蛋白凝胶抗氧化性的测定

1.3.8.1 ABTS自由基清除能力 参考Re等[20]的方法进行测定。分别取25 mL的7 mmol/L ABTS溶液和25 mL的2.45 mmol/L过硫化钾溶液混合均匀，置于室温下暗处放置12～16 h，得到ABTS储备液，使用前将储备液用蒸馏水稀释40～45倍使该溶液在734 nm下的吸光度值在0.70±0.02之间。取不同稀释倍数的肌原纤维蛋白凝胶溶液0.1 mL加入3.9 mL的ABTS溶液，摇匀，室温下放置6 mim后，在734 nm处测定吸光度。以蒸馏水代替样品做空白对照，对ABTS自由基的清除率以下列公式计算：

式中：A0—空白对照反应后的吸光度；AS—样品反应后的吸光度。

1.3.8.2 DPPH自由基清除能力 参考Yamaguchi等[21]的方法进行测定。样品组Ai用2 mL不同稀释倍数的肌原纤维蛋白凝胶溶液与DPPH溶液2 mL均匀混合；空白组Aj是用2 mL不同稀释倍数的肌原纤维蛋白凝胶溶液与2 mL乙醇均匀混合；对照组Ac为2 mL纯净水与DPPH溶液2 mL均匀混合。混合后立即在517 nm下测定吸光值，并在暗处放置30 min后再次测定吸光度。DPPH自由基清除率计算公式为：

1.3.8.3 羟自由基清除能力 采用邻二氮菲-Fe2+氧化法检测复合物对羟自由基的清除能力。在试管中加入2 mL 0.2 mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4），1.0 mL去离子水，摇匀；加入1.0 mL 0.75 mmol/L FeSO4，充分混匀；加入1.0 mL 0.01% H2O2，振荡1 min；加入1.0 ml 1.5 mmol/L邻二氮菲无水乙醇溶液，37 ℃水浴45 min；用725紫外-可见分光光度计于波长526 nm检测反应体系吸光度值Ap；以1.0 mL去离子水替代1.0 mL H2O2，其余条件相同，测其吸光度值Ab；以不同稀释倍数的肌原纤维蛋白凝胶溶液1.0 mL替代去离子水，其余条件相同，测其吸光度值As。

1.4 数据处理

所有实验数据均采用SPSS统计软件（19.0）分析，每组实验重复3次，数据结果以平均值±SD的方式表示。采用ANOVA进行邓肯氏多重差异分析。

2 结果与分析

2.1 牛骨胶原水解物添加量对肌原纤维蛋白总巯基的影响

总巯基是活性巯基和分子内部巯基的总和，指包埋于蛋白质分子内的和暴露在蛋白质表面的巯基，而活性巯基指暴露在蛋白质表面的巯基。不同牛骨胶原水解物添加量对肌原纤维蛋白总巯基的影响如图1所示。与未添加牛骨胶原水解物的肌原纤维蛋白相比，添加1%牛骨胶原水解物后，总巯基含量略有增加，此时二硫键形成较少，该浓度能有效抑制肌原纤维蛋白凝胶的变性程度，分析得出在此浓度下蛋白聚集主要依靠表面疏水相互作用[22]。随着牛骨胶原水解物添加量（3%～5%）的增大，总巯基含量呈显著下降趋势（P<0.05），杜慧颖等[23]研究发现，在一定浓度范围内，鲤鱼鱼鳞蛋白酶解液的增加，可延缓冻藏过程中鲤鱼肌原纤维蛋白总巯基含量下降，这与本研究结果相反，分析可能是高浓度牛骨胶原水解物影响了肌原纤维蛋白空间结构，使包埋于分子内部的巯基暴露出来，形成二硫键，导致巯基含量下降。后续还有待进一步深入研究。

图1 牛骨胶原水解物对肌原纤维蛋白总巯基的影响Fig.1 Effect of bovine-bone collagen hydrolysate on total sulfhydryl group of myofibrillar protein

2.2 牛骨胶原水解物添加量对肌原纤维蛋白活性巯基的影响

图2 牛骨胶原水解物对肌原纤维蛋白活性巯基的影响Fig.2 Effect of bovine-bone collagen hydrolysate on active sulfhydryl group of myofibrillar protein gel

肌原纤维蛋白含有大量的活性巯基，这些巯基很容易被氧化为分子内或分子间的二硫键，这也是氧化过程中肌原纤维蛋白聚合的主要途径。不同牛骨胶原水解物添加量对肌原纤维蛋白凝胶活性巯基的影响如图2所示。当添加1%的牛骨胶原水解物时，活性巯基含量显著增加（P<0.05）。肌原纤维蛋白分子结构展开，使包埋于内部的巯基不断暴露出来，造成表面巯基不断增加[24]。

当牛骨胶原水解物添加量为2%～4%时，活性巯基的含量呈显著下降趋势（P<0.05），由于牛骨胶原水解物的添加导致肌原纤维蛋白的游离巯基被氧化为二硫键及相关化合物，氧化同时引起蛋白质侧链结构发生修饰，导致游离巯基含量减少[25]。当牛骨胶原水解物添加量为5%时，活性巯基的含量有所回升，可能因为分子内分子间二硫键断裂[26]，使得巯基有所增加。

2.3 牛骨胶原水解物添加量对肌原纤维蛋白凝胶疏水性的影响

不同牛骨胶原水解物添加量对肌原纤维蛋白凝胶表面疏水性的影响如图3所示。肌原纤维蛋白在形成凝胶后其表面疏水性显著增加（P<0.05），增幅为73%。肌原纤维蛋白形成凝胶后表面疏水性的增加是由于加热过程中，蛋白质的二级结构展开使得疏水性基团暴露出来进而增加了蛋白质之间疏水相互作用力[27]。在加热过程中疏水相互作用逐渐增强成为肌原纤维蛋白凝胶中的主要化学作用力之一[28]。

图3 牛骨胶原水解物对肌原纤维蛋白凝胶表面疏水性的影响Fig.3 Effect of bovine-bone collagen hydrolysate on surface hydrophobicity of myofibrillar protein gel

与未添加牛骨胶原水解物相比，随着牛骨胶原水解物添加量的增加，肌原纤维蛋白表面疏水性显著增加（P<0.05），增幅分别为15.4%、9.6%、12.7%、8.5%、8.3%。添加牛骨胶原水解物之后导致了肌原纤维蛋白结构展开，使一些疏水基团暴露出来，且牛骨胶原水解物中甘氨酸含量最多，甘氨酸为疏水性氨基酸[29]，从而使肌原纤维蛋白凝胶表面疏水性增加。

牛骨胶原水解物添加量为1%～5%，肌原纤维蛋白凝胶表面疏水性总体呈下降趋势，随着牛骨胶原水解物添加量进一步増加，外露的疏水性基团越来越多，疏水相互作用越来越强，部分肌原纤维蛋白分子通过疏水相互作用形成聚集，使暴露在外面的疏水基团又被重新包埋，从而导致蛋白质表面疏水性下降[30]。

2.4 牛骨胶原水解物添加量对肌原纤维蛋白凝胶白度的影响

白度是评价鱼类凝胶制品品质的重要指标之一。不同牛骨胶原水解物添加量对肌原纤维蛋白凝胶白度的影响如图4所示。随着牛骨胶原水解物添加量的增多，肌原纤维蛋白凝胶白度整体呈现先上升后下降的趋势，当牛骨胶原水解物添加量为3%时，蛋白凝胶白度达到最高为38.46，这可能是由于一定量的牛骨胶原水解物可以使肌原纤维蛋白凝胶结构致密均匀，从而显示出更好的光泽度和亮度。

图4 牛骨胶原水解物对肌原纤维蛋白凝胶白度的影响Fig.4 Effect of bovine-bone collagen hydrolysate on whiteness of myofibrillar protein gel

当牛骨胶原水解物添加量大于3%，肌原纤维蛋白凝胶白度呈现下降趋势，这可能是随着水解物添加量增加，其中的甘氨酸含量也随之增多，甘氨酸作为疏水性氨基酸导致疏水作用力增大，凝胶内部作用力失去平衡，使凝胶结构的空隙不断增大导致肌原纤维蛋白凝胶白度下降[25]；也可能是牛骨胶原水解物添加量较大，搅拌溶解时间增加，进而导致肌原纤维蛋白在空气中暴露时间较长，从而导致凝胶白度降低，这与李艳青[31]在蛋白质氧化对肌原纤维蛋白凝胶性的影响研究中结论相符。

2.5 牛骨胶原水解物添加量对肌原纤维蛋白凝胶保水性的影响

不同牛骨胶原水解物添加量对肌原纤维蛋白凝胶保水性的影响如图5所示。随着牛骨胶原水解物添加的增多，肌原纤维蛋白凝胶的保水性呈先增加后下降趋势（P<0.05）。与添加1%牛骨胶原水解物样品相比，未添加牛骨胶原水解物的肌原纤维蛋白呈现出较低的保水性，可能是由于热激活内源蛋白酶而引起明显的蛋白水解，改变蛋白结构，进而使其保水能力降低。

图5 牛骨胶原水解物对肌原纤维蛋白凝胶保水性的影响Fig.5 Effect of bovine-bone collagen hydrolysate on water retention of myofibrillar protein gel

在牛骨胶原水解物添加量1%时，肌原纤维蛋白凝胶保水性达到最高（P<0.05），为89.25%。分析可能是低浓度的牛骨胶原水解物与肌原纤维蛋白凝胶形成较为致密的三维网络结构，从而包含更多的水分。之后随着牛骨胶原水解物添加量的增加，肌原纤维蛋白凝胶保水性逐渐下降。与添加1%牛骨胶原水解物样品相比，降低幅度分别为8.81%、8.29%、9.66%、10.65%。肌原纤维蛋白凝胶结构的变化与肌原纤维蛋白凝胶保水性的降低有很大关系，当牛骨胶原水解物添加量增大时，牛骨胶原水解物使肌原纤维蛋白浓度降低，阻碍了蛋白质之间的交联作用，并且影响了水分与肌原纤维蛋白之间氢键的形成，因此导致了肌原纤维蛋白凝胶保水性的下降[32−33]。

2.6 牛骨胶原水解物添加量对肌原纤维蛋白凝胶强度的影响

图6 牛骨胶原水解物对肌原纤维蛋白凝胶强度的影响Fig.6 Effect of bovine-bone collagen hydrolysate on the strength of myofibrillar protein gel

不同牛骨胶原水解物添加量对肌原纤维蛋白凝胶强度的影响如图6所示。随着牛骨胶原水解物添加的增多，肌原纤维蛋白凝胶强度呈先增加后下降趋势（P<0.05）。在添加量为1%时，凝胶强度达到最大，为153.24。之后随着牛骨胶原水解物添加量的增大，肌原纤维蛋白凝胶强度呈显著下降趋势（P<0.05）。推测低浓度牛骨胶原水解物混合添加到肌原纤维蛋白后，在加热过程中发生共价交联形成混合凝胶，使凝胶更加致密，进而增加凝胶强度。随着高浓度牛骨胶原水解物的加入，反而干扰了肌原纤维蛋白的凝胶作用，进而导致凝胶强度下降。

2.7 微观结构观察

凝胶的内部结构是确定凝胶强度的最关键参数之一。不同牛骨胶原水解物对肌原纤维蛋白凝胶内部结构影响见图7。由图7a可见未添加牛骨胶原水解物的肌原纤维蛋白凝胶显示出较松散且不规则的结构，其中包含有较大的空隙。随着牛骨胶原水解物添加量不断增多，肌原纤维蛋白凝胶结构开始发生改变，添加1%牛骨胶原水解物的肌原纤维蛋白凝胶，表现出紧密且有序的蛋白质网络，且空隙更少（图7b），这表明1%牛骨胶原水解物可有效抑制肌原纤维蛋白的降解，与此同时牛骨胶原水解物可能作为填充剂，在蛋白质网络中均匀分配，从而导致内源蛋白酶引起的蛋白水解被抑制[34]。从毛细管现象的作用原理来看，这种结构均匀致密的蛋白质相互交联网络结构更有利于水分的保持[35]。这与其凝胶强度大、保水性好结果相符。

图7 不同牛骨胶原水解物的肌原纤维蛋白凝胶电镜图Fig.7 Electron micrograph of myofibrillar protein gel of different bovine-bone collagen hydrolysates

随着牛骨胶原水解物添加量的增多，肌原纤维蛋白凝胶所形成的网络结构呈现出无序和松散的网络，线条粗细不均匀，形成大小不同的空洞（图7c～f）。这可能是因为在牛骨胶原水解物干扰了肌原纤维蛋白凝胶作用，使其凝胶内部作用力失去平衡，造成凝胶结构的空隙不断增大，形成不规则的凝胶网状结构，这也导致肌原纤维蛋白凝胶质的构特性和保水性降低[36−37]。

2.8 红外光谱分析

红外光谱能够提供样品中分子间和分子内部官能团相互作用的信息，对添加牛骨胶原水解物的肌原纤维蛋白凝胶特征吸收峰进行了归属，见图8。酰胺A带在3473 cm−1有最大吸收峰，且呈宽峰，这与氢键中的O-H振动伸缩有关。添加牛骨胶原水解物后，酰胺A带在此波数下宽吸收峰出现一定程度的增强，氢键影响吸收峰的变化，这表明添加牛骨胶原水解物可能引起了凝胶体系氢键的增强，分析可能是牛骨胶原水解物具有的持水能力引起氢键的增加。肖旭华[38]研究米渣蛋白对鲢鱼糜凝胶体系的影响时，得到与本试验一致的结论。3060.89 cm−1处的吸收峰是酰胺B带的C-N伸缩振动产生的，2923.96 cm−1处的吸收峰是酰胺B带的CH2不对称伸展振动产生的。

图8 添加牛骨胶原水解物的肌原纤维蛋白红外光谱图Fig.8 Infrared spectra of myofibrillar protein added with bovine-bone collagen hydrolysate

1658.71 cm−1处是酰胺Ⅰ带的C=O的伸缩振动产生的。1546.84 cm−1处归属于酰胺Ⅱ带的C-N的伸缩振动和N-H的弯曲振动。1244.03 cm−1处归属于酰胺Ⅲ带的C-H的伸缩振动和N-H的弯曲振动。添加牛骨胶原水解物后，肌原纤维蛋白凝胶在酰胺I区的吸收峰无显著变化；在酰胺II区，肌原纤维蛋白凝胶的最大吸收峰波数发生蓝移，这可能是由于蛋白质二级结构发生变化，骨胶原蛋白水解物与肌原纤维蛋白在疏水相互作用、氢键等作用下产生了一定的交联[2]。

2.9 牛骨胶原水解物添加量对肌原纤维蛋白凝胶抗氧化性的影响

牛骨胶原水解物的抗氧化性结果如图9所示。随着牛骨胶原水解物添加量的增大，肌原纤维蛋白凝胶对ABTS自由基清除能力呈现增加的趋势，分析增加的原因可能是酶解牛骨胶原蛋白后产生了大量含有抗氧化活性的氨基酸肽段，使得肌原纤维蛋白凝胶清除ABTS自由基能力增大[39]。当牛骨胶原水解物添加量在3%时，肌原纤维蛋白凝胶的抗氧化能力达到最高，清除率为26.04%。

图9 牛骨胶原水解物对肌原纤维蛋白凝胶ABTS、DPPH和羟自由基清除率的影响Fig.9 Effect of bovine-bone collagen hydrolysate on ABTS,DPPH and hydroxyl radicals scavenging rate of myofibrillar protein gel

DPPH是一类较稳定的芳香类自由基，DPPH也可以反映抗氧化物清除自由基的能力。随着牛骨胶原水解物添加量的增加，蛋白凝胶清除DPPH自由基的能力呈现先增加后降低的趋势。当牛骨胶原水解物添加量为1%时，其DPPH自由基清除率达到最高，为83.99%。可能添加该浓度的牛骨胶原水解物会更好地使蛋白分子展开，暴露出更多的疏水基团，使其更易与脂溶性的DPPH自由基反应，从而提升了DPPH自由基清除能力。Deng等[40]利用胃蛋白酶消化鱼蛋白获得的水解产物对DPPH自由基具有一定的清除作用，同时水解产物可明显抑制冷藏南美对虾肌原纤维蛋白的氧化。

随着牛骨胶原水解物添加量的增大，肌原纤维蛋白凝胶对羟自由基的清除能力呈先升高后下降趋势。在牛骨胶原水解物添加量为1%时，蛋白凝胶对羟自由基清除率达到最高，为48.35%。牛骨胶原水解物中含有的还原性氨基酸，对清除羟自由基具有一定的作用[13]。Zhang等[7]研究也发现，经胰蛋白酶和碱性蛋白酶酶解鱼糜处理副产品（SPB），获得的SPB水解物对silver鱼鱼糜具有较好的抗氧化作用。

3 结论

本实验分析了牛骨胶原水解物加入鲢鱼肌原纤维蛋白后巯基、表面疏水性、凝胶性能、微观结构及抗氧化作用的变化。1%牛骨胶原水解物可减缓肌原纤维蛋白总巯基和表面疏水性的下降，保持较高的凝胶强度和保水力，扫描电镜观察也同样显现出致密的微观结构。1%牛骨胶原水解物-肌原纤维蛋白凝胶抗氧化作用显著（P<0.05），对DPPH自由基和羟自由基清除能力均达到最高，分别为83.99%和48.35%。低浓度牛骨胶原水解物具有抑制肌原纤维蛋白氧化和增强凝胶强度的作用，可以作为水和肉蛋白之间的粘合剂，应用于鱼糜制品中。