糖肾方治疗糖尿病肾病心肌纤维化的实验研究及网络药理学研究

赵婷婷，胡 琳，2，张浩军，李 平★

（1.中日友好医院 临床医学研究所；北京市免疫炎性疾病重点实验室，北京 100029；2.北京化工大学 生物工程专业，北京 100029）

心肌纤维化是大多数心血管疾病共同病理特征，主要表现为心肌成纤维细胞过度增殖以及细胞外基质过度沉积[1]。心肌纤维化不仅是导致心力衰竭的一个主要原因，而且与心血管死亡风险直接相关[2，3]。糖尿病肾 病（diabetic kidney disease，DKD）伴发心血管疾病的风险高，患者因心血管疾病导致死亡的可能性是其进入终末期肾病的5～10 倍[4]。因此对DKD 患者的治疗应重视减轻其心血管损伤。糖肾方是课题组在继承名老中医经验基础上研制的治疗DKD 复方中药，前期多中心临床试验和体内动物实验均显示其疗效确切[5～8]。

本文旨在探讨糖肾方治疗DKD 大鼠心肌纤维化的作用，并用网络药理学方法对糖肾方活性化合物成分及抗纤维化靶点进行系统研究。

1 材料与方法

1.1 动物造模与给药

Wistar 大鼠20 只，雄性，体重180～220g，北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号：SCXK （京） 2007-0001。适应性喂养1 周，行基础状态测定，剔除血糖与尿蛋白异常的动物。大鼠腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，常规消毒，背部切口1～1.5cm，暴露右肾，剥离肾脏脂肪及肾上腺，结扎右肾门血管，切除右肾，缝合切口。术后1 周后，按40mg/kg 腹腔注射1%的链脲佐菌素，72h后尾尖采血测血糖，＞16.7mmol/L 为造模成功[9]。另取6 只动物作为空白组，戊巴比妥钠麻醉后进行假手术，消毒切口后暴露右肾，不做其他处理，缝合切口，1 周后腹腔注射柠檬酸缓冲液。

造模成功大鼠12 只，随机分为模型组和糖肾方治疗组（2.67g/kg/d，相当于临床剂量10 倍），每组6 只。空白组和模型组大鼠给予同容积的蒸馏水，连续给药20 周。糖肾方配方颗粒由江阴天江药业有限公司加工，4g/袋，批号060632。

造模后第20 周，戊巴比妥钠麻醉处死动物，取心肌组织固定于10%中性甲醛溶液，包埋切片后进行Masson’s trichrome 染色。光镜下观察心肌组织病理学变化，并采用Image J 软件统计其胶原面积百分比。

1.2 网络药理学研究

1.2.1 主要化合物成分筛选和收集

利用中药系统药理学数据库和分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP） 分别检索出糖肾方七味中药（大黄、地黄、黄芪、三七、枳壳、山茱萸、鬼箭羽）的化合物成分，采用网络药理学中常用的化合物成分筛选方法和条件，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%且类药性（drug like，DL）≥0.18 筛选化合物成分作为候选活性成分。

1.2.2 化合物靶点收集

通过中医药百科全书 （the Encyclopedia of Traditional Chinese Medicine，ETCM）数据库、证候关联（Symptom Mapping，SymMap）数据库、化学相似性系综法（similarity ensemble approach，SEA）搜索引擎和STITCH 数据库检索候选活性成分靶点，将整理收集到的靶点导入Uniprot 数据库，剔除非人源靶点，并将靶点的基因名称校正为通用名称，建立成分-靶点数据集。

1.2.3 化合物-靶点相互作用网络的构建

使用Cytoscape3.7.2 对查询到的化合物成分以及其对应的作用靶点进行相关网络构建。

1.2.4 疾病靶点的获取

在OMIM 数据库、 TTD 数据库、Drugbank 数据库和Pubmed-gene 数据库中检索关键词“myocardial fibrosis”，收集心肌纤维化疾病相关靶点。

1.2.5 药物-疾病蛋白质互作（protein-protein interaction，PPI）网络图及Hub 基因分析

将糖肾方主要化合物成分靶点与心肌纤维化靶点相关靶蛋白上传至String 数据库，获取PPI数据，以置信度为0.7 为筛选条件，确保其数据的可靠性，后建立药物-疾病PPI 网络图。将得到的PPI 数据导入到Cytoscape 3.7.2 进行可视化分析，利用cytoHubba 插件中基于度的方法计算得到网络拓扑参数，选择二者共同拥有且degree 数值排名前20 的靶点作为糖肾方映射到心肌纤维化发病的关键靶点。

1.2.6 靶基因功能富集和通路分析

通过DAVID 将PPI 网络中的节点蛋白进行基因本体（gene ontology，GO）功能富集和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes） 通路富集分析，将分析结果在R 软件中进行图形可视化，得到糖肾方化合物靶点蛋白的基因功能以及糖肾方治疗DKD 心肌纤维化的潜在作用靶点在信号通路中的作用。

2 结果

2.1 糖肾方对DKD 大鼠心肌纤维化的治疗作用

通过Masson’s trichrome 染色观察各组大鼠心肌胶原沉积状况，发现DKD 大鼠心肌间质和心肌微血管周围胶原沉积增多、 纤维化发生情况显著（P<0.05），给予糖肾方20 周干预后可显著降低DKD 大鼠心肌纤维化状况 （P<0.05，图1 见封底）。

图1 糖肾方显著降低单侧肾切除合并链脲佐菌素诱导的糖尿病肾病大鼠心肌胶原沉积（Masson’s trichrome染色，×200）。A.假手术组；B.糖尿病肾病模型组；C. 糖尿病肾病+糖肾方治疗组；D.各组胶原面积百分比半定量分析。

2.2 糖肾方中候选化学成分

通过TCMSP 数据库的检索，收集到大黄100个、鬼箭羽120 个、黄芪117 个、三七221 个、 山茱萸299 个、枳壳18 个、地黄86 个化学成分。经OB 和DL 筛选，得到268 个有效活性成分：大黄24 个、鬼箭羽25 个、黄芪41 个、三七51 个、山茱萸100 个、枳壳12 个、地黄15 个。

2.3 糖肾方化合物靶点收集

通过 ETCM、SymMap、SEA搜索引擎和STITCH 数据库检索候选活性成分的靶点，268 个化合物活性成分对应7751 个作用靶点：其中大黄对应靶点1105 个，鬼箭羽214 个，黄芪1343 个，三七1527 个，山茱萸1608 个，枳壳1542 个，地黄412 个。在靶点与药物的相互对应关系中，存在多种中药共有多个相同的靶点。

2.4 糖肾方-心肌纤维化相互作用网络的构建

在OMIM、TTD、Drugbank 和Pubmed-gene 数据库检索关键词，共收集到601 个心肌纤维化疾病相关靶点。将糖肾方活性成分靶点和心肌纤维化疾病靶点匹配后，得到277 个潜在靶点。

2.5 Hub 基因分析及与活性化合物对应关系

“度值”表示网络中节点与节点相连的数目。度值（degree）排名前20 的关键靶点基因网络连接情况见图2。将上述靶点依次导入DisGeNET 数据库，得到其蛋白属性。大部分基因都参与炎症反应，如IL6、IL4、TLR4、IL1A、CXCR4 等；VEGFA、KDR 等主要参与血管细胞内皮的增殖分裂、从而促进新生血管的生成；FN1 作为纤维连接蛋白，影响心肌纤维化；此外，还有一些靶点参与了信号传导、物质运输和酶活调节等。

图2 糖肾方治疗心肌纤维化前20 个关键靶点相互作用网络图

糖肾方七味药共有49 个化合物参与前20 个靶点蛋白的调控，同时调控3 个以上靶点的化合物有9 个。其中β-谷甾醇（Beta-sitosterol）是大黄、三七、山茱萸、枳壳和鬼箭羽五味药的共同活性成分；槲皮素（quercetin）是黄芪、鬼箭羽、山茱萸和三七四味药的共同活性成分，山奈酚（kaempferol）是黄芪和鬼箭羽的共同活性成分；谷甾醇（sitosterol）是地黄、山茱萸、鬼箭羽的共同活性成分。

2.6 GO 富集和KEGG 通路分析

对筛选到的277 个靶点进行GO 富集分析，按显著性由高到低排序并绘制了气泡图。我们发现糖肾方的关键靶点主要富集于2741 个生物过程、72 个细胞组分和167 个分子功能。

在生物学过程 （biological process，BP） 分析中，糖肾方对循环系统过程、血液循环、调节血管系统发育、肽基酪氨酸磷酸化、肽基酪氨酸修饰等影响较大。

分子功能（molecular function，MF）分析显示（图3，见封底），糖肾方成分的功能主要与受体配体活性（receptor ligand activity）、细胞因子受体结合（cytokine receptor binding）、细胞因子活性（cytokine activity）、生长因子活性（growth factor activity）、氨基化合物结合（amide binding）关系密切。

图3 糖肾方治疗心肌纤维化靶点蛋白GO富集分析（分子功能）

在细胞组分（cellular component，CC）分析中，这些靶点主要与细胞外基质、囊腔、胞质囊腔、内质网腔、质膜的外侧等相关。

KEGG 通路分析中，共得到136 条具有明显意义的通路（P<0.05，FDR<0.05），靶点参与的主要通路见图4 （封底），X 轴表示富集因子、Y 轴为通路名称，气泡颜色代表在该条通路上靶基因的富集程度，气泡大小代表该条通路上所富集基因数量。10 条通路中，与糖肾方治疗心肌纤维化相关度最高的通路依次为：细胞因子-细胞因子受体相互作用（cytokine-cytokine receptor interaction）、液体剪切应力和动脉粥样硬化信号 （fluid shear stress and atherosclerosis）、 蛋白多糖在癌症中的作用（proteoglycans in cancer）、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路 （AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）等。

图4 糖肾方治疗心肌纤维化靶点蛋白KEGG通路分析

3 讨论

文献研究[10，11]发现糖肾方的七味药中黄芪、山茱萸、三七、枳壳等均在心血管系统疾病中广泛应用，具有良好保护作用。本文采用单侧肾切除合并链脲佐菌素腹腔注射诱导的DKD 大鼠，进行糖肾方治疗20 周，首次发现糖肾方具有显著抑制DKD 心肌纤维化的作用。

网络药理学研究发现，炎症反应相关基因、促血管生成基因和纤维化标志分子是糖肾方治疗心肌纤维化的关键靶点。炎症被认为是心肌纤维化重要诱因，抗炎治疗能够减轻慢性肾脏病患者心血管风险[12]。炎症能够诱导释放IL-1、IL-6，IL-1β，IL-8，TNF-α、TGF-β、CRP、 纤维蛋白原等细胞因子[13]，它们诱导了前纤维化和动脉粥样硬化的进程。糖肾方治疗心肌纤维化相关度最高的通路为细胞因子-细胞因子受体相互作用通路。细胞因子可分为促炎因子和抗炎因子。IL-6 是糖肾方治疗心肌纤维化网络节点度值最高的靶点，它是一个多效细胞因子，具有促炎作用。有研究证实，心脏成纤维细胞过度合成IL-6，会促使纤维化因子表达，加速心肌纤维化[14]，而IL-6 抑制剂能够有效减轻模型小鼠的心肌纤维化程度[15]。课题组前期发现糖肾方能够显著抑制DKD 大鼠肾脏和循环系统IL-6 等炎症因子的表达[6]，提示抑制炎症反应可能是糖肾方有效治疗糖尿病肾脏和心脏损伤的共同机制。

糖肾方七味药有效成分众多，其中槲皮素、黄芩素、山奈酚、人参皂苷rh2、柚皮素、油酸、亚油酸、芦荟大黄素等化合物作用靶点最多，是糖肾方治疗心肌纤维化的主要活性成分。槲皮素和黄芩素均能够抑制AngII 诱导的心肌成纤维细胞胶原I 和胶原III 的分泌[16，17]，该作用在AngII 心肌纤维化小鼠和异丙肾上腺素心肌纤维化大鼠模型上得到验证[18，19]。槲皮素、黄芩素、山奈酚和柚皮素4 种化合物均是黄酮类化合物，提示黄酮类化合物可能是糖肾方治疗心肌纤维化的有效部位。