硒对芥蓝硫代葡萄糖苷含量与组分的影响

李伟强 李 阳 王丽丽 郁有健 朱祝军

（浙江农林大学农业与食品科学学院，浙江省农产品品质改良技术研究重点实验室，浙江杭州 311300）

芥蓝（Brassica albograbraL.H.Bailey）是十字花科芸薹属一年生或二年生草本植物，以带叶的菜薹为食用部位，是我国的特产蔬菜之一，其营养丰富，尤其是硫代葡萄糖苷含量较高。硫代葡萄糖苷（glucosinolates，简称硫苷）是一类在植物体内合成的含硫、含氮次生代谢产物，主要存在于十字花科植物中，它们的降解产物使得植物具有香、苦、辛辣等味道，是十字花科蔬菜风味和气味形成的主要前体物质（Bones &Rossiter，2006）。目前鉴定出来的硫苷种类已经超过200 种，研究表明大多数硫苷降解产物具有抗菌、抗虫以及抗癌等功能（Masahiko et al.，2014；何玲莉 等，2018）。硫苷在癌症的预防等方面能够发挥极大的作用，其被摄入人体后通过肠道的酶解作用分解为异硫氰酸酯，而异硫氰酸酯与致癌物代谢激活的抑制作用有关（Keum et al.，2004）。硫苷合成与调控受多种因素的影响，在硫苷合成的不同阶段受到众多基因调控，同时也受到外部多种因素影响，如外源非生物和生物胁迫以及各种植物激素等（程坤 等，2010；王军伟，2019）。陈微（2017）在研究外源激素对萝卜肉质根硫苷含量的影响中发现，外源茉莉酸甲酯可以增加萝卜肉质根硫苷的累积，而外源脱落酸处理则抑制萝卜肉质根硫苷的累积。Jasper 等（2020）在研究温度对芝麻菜硫苷含量的影响中发现，高温能够增加芝麻菜硫苷的累积，但植株生长和生物量显著降低。

硒（selenium，Se）是一种重要的稀有元素，对于植物的正常生长发育及人体和动物维持机体健康、抗癌等方面具有重要作用（李颂 等，2014；许月明 等，2018）。适量的硒元素能够促进植株在逆境下的生长发育，增强植物的抗性。研究表明，适宜浓度的硒可以促进番茄、叶用莴苣、菠菜、普通白菜等蔬菜作物的生长、提高产量、改善品质，且能提高植株的抗逆性，但过量的硒对植株却有毒害作用（Yu &Gu，2007；韩亚文 等，2014；Pezzaressa et al.，2017）。李乐等（2020）研究表明，适宜浓度的硒处理可以增加番茄可溶性固形物含量，改善果实品质，提高产量和矿物质元素含量。Rouhollah 等（2020）研究表明，叶面喷施适量硒溶液可以提高葡萄叶片矿质元素含量，改善植株营养平衡和抗氧化能力，提高耐盐性。本试验采用高效液相色谱法（HPLC）对不同浓度亚硒酸钠处理的芥蓝植株中硫苷组分及含量进行测定和分析，旨在探索硒对芥蓝硫苷含量与组分的影响，以期为育种和栽培实践中高品质芥蓝的培育和改良提供理论依据和数据支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料及处理方法

供试芥蓝品种为大笋迟花（汕头市利农种业有限公司），硒试剂为亚硒酸钠（Na2SeO3）。试验于2019 年11 月在浙江农林大学进行，芥蓝种子播于人工气候室的培养蛭石中，生长至3～4 片真叶时挑选长势一致的幼苗，移栽到10 L 的塑料箱中，每箱定植6 株；采用Hoagland 营养液在人工气候室中进行培养，光周期为16 h/8 h（昼/夜，下同），温度为26 ℃/24 ℃，每周更换2 次营养液，培养4周后进行不同浓度硒处理。设置亚硒酸钠浓度分别为0（CK）、0.5、5、50 μmol · L-1，每处理3 次重复，每重复1 箱。培养48 h 后取样进行硫苷含量测定，分别采收地上部和根部，迅速用液氮冷冻，真空冷冻干燥后粉碎，超低温（-80 ℃）保存备用。

1.2 硫苷提取及测定方法

硫苷的提取及测定参照Krumbein 等（2005）的方法，并经过Zhu 等（2015）改良。称取0.25 g 冻干样品，加入70%甲醇溶液4 mL，同时加入5 mmol · L-1的金莲葡糖硫苷（applichem，USA）200 μL 作为内标。75 ℃水浴锅水浴10 min，然后5 800 r · min-1离心10 min，收集上清液；剩余沉淀继续用70%甲醇提取2 次，合并上清液，定容至10 mL。取5 mL 粗提液，用DEAE Sephadex A25（Amersham Biosciences，Sweden）固相萃取柱进行萃取，待提取液全部流出小柱后加入200 μL 硫酸酯酶（Sigma-Aldrich，USA），室温反应12 h，然后用5 mL 超纯水洗脱，洗脱液用0.45 mm 滤膜过滤。

采用高效液相色谱法（HPLC）测定样品的硫苷组分与含量。进样量为20 μL；色谱柱为C-18 反相柱（250 mm × 4 mm，5 μm，Bischoff，Germany），柱温30 ℃。流动相A（Milli-Q 超纯水）和B（乙腈，Tedia 公司）呈梯度变化：0 min，乙腈0；45 min，乙腈20%；46 min，乙腈100%。检测波长为229 nm，流速1 mL · min-1。根据液相色谱图对硫苷各组分进行鉴定，硫苷含量根据内标的值和响应因子进行计算。

1.3 数据处理

试验数据采用SPSS 23.0 软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 芥蓝地上部和根中硫苷组分分析

芥蓝0 μmol · L-1亚硒酸钠处理的HPLC 测定结果及详细信息见图1 和表1。由图1 和表1 可知，芥蓝地上部和根中分别检测到9 种和8 种硫苷组分，其中IBE、PRO、SIN、RAA 和NAP 为脂肪族硫苷，4OH、GBC、4ME 和NEO 为吲哚族硫苷；地上部和根中均未检测到芳香族硫苷。

表1 芥蓝地上部和根中的硫苷组分

2.2 不同浓度硒处理对芥蓝总硫苷含量的影响

由表2 可知，不同浓度亚硒酸钠处理对芥蓝植株不同部位总硫苷含量的影响不同。与对照相比，5 μmol · L-1亚硒酸钠处理的芥蓝地上部和根部总硫苷含量均显著增加；0.5 μmol · L-1和50 μmol · L-1亚硒酸钠处理的地上部总硫苷含量显著高于对照，而根部总硫苷含量显著低于对照。

不同浓度亚硒酸钠处理对芥蓝植株不同部位的脂肪族硫苷和吲哚族硫苷含量影响也不同（表2）。3 种浓度亚硒酸钠处理芥蓝地上部脂肪族硫苷含量均显著高于对照，而吲哚族硫苷含量均与对照无显著差异。5 μmol · L-1亚硒酸钠处理芥蓝根部吲哚族硫苷含量显著高于对照，而0.5 μmol · L-1和50 μmol · L-1亚硒酸钠处理显著低于对照；3 种浓度亚硒酸钠处理的芥蓝根部脂肪族硫苷含量与对照均无显著差异。

表2 不同浓度硒处理对芥蓝地上部和根中总硫苷、脂肪族硫苷、吲哚族硫苷含量的影响 μmol · g-1（DW）

2.3 不同浓度硒处理对芥蓝中各硫苷组分含量的影响

由表3 可知，不同浓度亚硒酸钠处理对芥蓝不同部位硫苷组分含量有重要影响。地上部的IBE、PRO、SIN、4ME、NEO 等5 种硫苷含量均随着亚硒酸钠浓度的提高呈现先增加后减少的变化趋势，其中IBE、SIN 和4ME 在5 μmol · L-1亚硒酸钠处理时含量达到最高值，分别是对照的2.86、4.77 倍和1.68 倍；RAA 在3 个亚硒酸钠浓度处理下均检测不到。根部不同浓度亚硒酸钠处理对各硫苷组分含量的影响程度均小于对地上部的影响，其中3 种浓度亚硒酸钠处理的PRO、SIN、NAP、GBC 含量均与对照无显著差异。

表3 不同浓度硒处理对芥蓝中各硫苷组分含量的影响

3 结论与讨论

本试验采用高效液相色谱法在芥蓝地上部和根中分别检测到9 种和8 种硫苷组分，其中IBE、PRO、SIN、RAA 和NAP 为脂肪族硫苷，4OH、GBC、4ME 和NEO 为吲哚族硫苷，没有检测到芳香族硫苷。此前，何洪巨等（2002）在芥蓝中共检测到7 种硫苷，分别属于脂肪族硫苷和吲哚族硫苷两大类；陈新娟（2006）在芥蓝叶和薹中共检测到10 种硫苷，未检测到芳香族硫苷；司雨等（2009）在不同品种芥蓝中共检测到9 种硫苷，也未检测到芳香族硫苷。研究表明，不同十字花科蔬菜所含硫苷组分和含量有所不同，甚至同一亚种的不同品种之间硫苷组分与含量也有较大差异（Farnham et al.，2004；Sun et al.，2011）。本试验中检测到的9 种硫苷包括了何洪巨等（2002）检测到的7 种硫苷，但未检测到陈新娟（2006）检测到的5-甲基亚硫酰丁基硫苷，且与司雨等（2009）检测到的硫苷组分也有所不同，这可能是由于试验所用的芥蓝品种不同而导致的。

本试验结果表明，5 μmol · L-1亚硒酸钠处理的芥蓝地上部和根中总硫苷含量均显著高于对照，但对不同部位各硫苷组分含量的调控具有不同作用，地上部IBE、SIN、NAP、4OH 和4ME 的含量比对照显著增加，而根部仅IBE 和4ME 含量显著增加。研究表明，外源葡萄糖和茉莉酸甲酯处理能显著提升芥蓝硫苷及抗氧化活性物质的累积（苗慧莹 等，2018）；25 μmol · L-1外源硒处理能够提高青花菜幼苗中硫苷的含量，并促进其化学防御物质的累积（Avila et al.，2013）。本试验发现，适宜浓度的外源硒处理能够显著提高芥蓝植株不同组织器官中的硫苷含量，推测其化学防御体系和抗氧化能力也会受到一定影响。此外，十字花科蔬菜的苦味来源于PRO、SIN、GBC、4ME 和NAP，其中SIN是导致十字花科蔬菜具有特殊辛辣味的主要物质（Schonhof et al.，2010；Bell et al.，2018）。本试验中，芥蓝植株地上部PRO、NEO 含量在50 μmol · L-1亚硒酸钠处理时有所下降，而IBE、SIN、4ME 含量各浓度亚硒酸钠处理均增加，推测硒处理能够通过影响芥蓝中不同硫苷组分的含量进而使芥蓝的风味得以改变，需要进一步深入研究来揭示其具体会产生何种变化。

此前对十字花科作物中硫苷的抗癌性已有较多研究，SIN、RAA 和4OH 等被证明具有防癌及抗癌作用，其中4OH 的降解产物吲哚-3-甲醇具有抑制癌细胞增殖和诱导癌细胞凋亡的作用（Jie et al.，2014；Tripathi et al.，2015；Asuncion et al.，2018）。Almuhayawi 等（2020）研究表明，高CO2浓度处理可以提高青花菜硫苷水平从而使其累积的抗癌活性物质含量升高。本试验中，芥蓝地上部只在对照中检测到RAA，根部未检测到RAA；地上部及根部的4OH 含量均在5 μmol · L-1亚硒酸钠处理时达到最高值。表明适宜浓度的外源硒处理能明显增加芥蓝中4OH 的含量，但不能提升RAA 的含量。研究结果能够为今后生产实践中培育具有较高抗癌活性物质的芥蓝等十字花科蔬菜作物提供一定的参考。