ERS信号通路在哮喘小鼠气道黏液高分泌及气道重塑中的作用研究*

陈家亮，周向东，陈小妹，李 琪，刘 锋

(1.海南医学院第一附属医院呼吸内科,海口 570102;2.急救与创伤研究教育部重点实验室，海口 571199;3.海南医学院第一附属医院全科医学科，海口 570102)

哮喘属异质性疾病，每年有25万人因哮喘而死，且中国哮喘患者约3 000万人，已成为影响公共健康隐患[1]。哮喘由多因素引起，且由多种细胞和细胞组分参与，常伴随炎性反应、气道高反应性、气道重塑，导致上皮细胞黏液化、杯状细胞增生等症状，从而造成气流不畅、气道阻力过大，影响肺正常生理功能[2-4]。内质网在蛋白翻译、修饰、正确折叠等过程中均发挥重要作用，当机体处于应激状态时，内质网中蛋白异常激活状态，在哮喘中内质网应激(ERS)影响气道重塑[5]、气道黏液高分泌[6]，推测抑制ERS可缓解哮喘。本研究采用卵清清蛋白(OVA)+氢氧化铝制备哮喘模型，探究哮喘模型中ERS抑制剂4-苯基丁酸(4-PBA)处理对哮喘的影响，并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物

选择无特定病原体(SPF)级雌性C57BL/6小鼠24只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。8周龄、体重20～22 g，均在海南医学院第一附属医院动物饲养中心(12 h/12 h)光照/黑暗、温度(25±1)℃、湿度(50±5)%环境中常规饲养。本实验经海南医学院第一附属医院动物伦理委员会审核并批准(伦理批准文号：2018LL0129)。

1.1.2药品、试剂及仪器

OVA、4-PBA购自美国Sigma公司(CAS号：9006-59-1、E7144)；苏木精-伊红(HE)染色试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司(货号：C0105)；马松(Masson)染色试剂盒、过碘酸雪夫(PAS)染色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司(货号：G1340、G1285)；小鼠白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒，一抗兔抗肌醇需求酶1α(IRE1α)、活化转录因子6(ATF6)、ERS相关基因C/EBP同源蛋白(CHOP)、葡萄糖调节蛋白78(GRP78)购自英国Abcam公司(货号：ab203360、ab208348、ab48187、ab37149、ab11419、ab108615)。蛋白凝胶成像系统购自美国ProteinSimple公司(型号：FluorChem)。

1.2 方法

1.2.1动物分组及模型制备

实验分为对照组、模型组、ERS抑制剂组，每组8只。除对照组外，其余各组在第1、7、14天腹腔注射200 μL OVA 20 μg和氢氧化铝2 mg的混合液致敏，对照组在同一天腹腔注射200 μL生理盐水。自第21天起，腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉小鼠，OVA 40 μg滴鼻激发哮喘发作，连续6周，每周3次，对照组则在相同时间生理盐水滴鼻。从第21天起ERS抑制剂组每次激发前30 min灌胃0.35 mg/g 4-PBA，对照组和模型组灌胃等体积生理盐水。

1.2.2样本收集

最后1次激发24 h后，立即处死小鼠，22G留置针气管插管并固定，结扎右侧主支气管，行左侧肺支气管肺泡灌洗0.8 mL PBS灌洗肺3次，收集支气管肺泡灌洗液(BALF)，左肺迅速置于4%多聚甲醛中固定，右肺置于-80 ℃冰箱待检。

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1.2.3BALF细胞计数

1 500 r/min、4 ℃离心BALF 10 min，取出上清液，1 mL PBS重悬细胞，涂片后光学显微镜下进行细胞总数计数，并计数200个左右白细胞中嗜酸粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞个数。

1.2.4ELISA检测BALF中IL-6、TNF-α水平

严格按照小鼠IL-6、TNF-α ELISA试剂盒说明检测BALF中IL-6、TNF-α水平。

1.2.5HE染色检测肺组织形态情况

4%多聚甲醛固定、石蜡包埋组织，肺门水平横切制切片(厚度5 μm)。每组取部分切片，经常规脱蜡、梯度乙醇脱水、HE染色，经二甲苯透明、自然干燥后中性树胶封片。显微镜下观察病理变化。

1.2.6Masson染色检测肺组织胶原沉积情况

每组取部分切片，脱蜡至水，经Masson复合染液染色、0.2%醋酸清洗，5%钨钼酸染色、0.2%醋酸清洗，苯胺蓝染色、0.2%醋酸水洗，梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。显微镜下观察胶原沉积变化。

1.2.7PAS染色检测肺组织杯状上皮细胞增生情况

每组取部分切片，脱蜡至水，经3%醋酸洗、阿利新蓝染、蒸馏水去浮、0.5%过碘酸染、蒸馏水去浮，70%乙醇清洗，Schiff染色，苏木素染核，梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。显微镜下观察肺组织杯状上皮细胞增生情况。

1.2.8Western blot检测肺组织中IRE1α、ATF6、CHOP、GRP78表达情况

-80 ℃取部分肺组织，蛋白裂解液裂解提取肺组织总蛋白，凝胶电泳分离蛋白、PVDF转膜、5%脱脂奶粉室温封闭，加入对应一抗IRE1α、ATF6、CHOP、GRP78、GAPDH，4 ℃孵育过夜；加入二抗室温孵育1 h。蛋白凝胶成像系统拍照和定量分析。目的蛋白相对表达水平=目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 3组小鼠BALF中细胞计数情况

与对照组比较，模型组小鼠BALF中细胞总数、嗜酸粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞数量升高(P<0.05)；与模型组比较，ERS抑制剂组小鼠BALF中细胞总数、嗜酸粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞数量降低(P<0.05)，见表1。

表1 3组小鼠BALF中细胞计数比较

2.2 3组小鼠BALF中IL-6、TNF-α表达情况

与对照组比较，模型组小鼠BALF中IL-6、TNF-α水平升高(P<0.05)；与模型组比较，ERS抑制剂组小鼠BALF中IL-6、TNF-α水平降低(P<0.05)，见表2。

表2 3组小鼠BALF中IL-6、TNF-α水平比较

2.3 3组小鼠肺组织形态、胶原沉积及杯状上皮细胞增生情况比较

对照组小鼠气道及肺血管正常、胶原沉积较少，几乎看不到杯状上皮细胞增生；模型组小鼠肺血管周围聚集大量炎症细胞、肺泡间隔增厚、结构破坏、平滑肌增厚，胶原纤维沉积明显增加，杯状细胞数量明显增多；与模型组比较，ERS抑制剂组小鼠肺血管周围炎症细胞数量减少、肺泡间隔有所增加，但结构破坏仍严重，胶原纤维沉积、杯状细胞数量均降低，见图1。

图1 3组小鼠肺组织气道重塑、胶原沉积、杯状上皮细胞增生情况(×200)

2.4 3组小鼠肺组织中相关蛋白表达水平比较

与对照组比较，模型组小鼠肺组织中IRE1α、ATF6、CHOP、GRP78表达水平升高(P<0.05)；与模型组比较，ERS抑制剂组小鼠肺组织中IRE1α、ATF6、CHOP、GRP78表达水平降低(P<0.05)，见表3、图2。

表3 3组小鼠肺组织中IRE1α、ATF6、CHOP、GRP78表达水平比较

图2 3组小鼠肺组织中相关蛋白表达水平

3 讨 论

气道黏液高分泌导致气道腺体和杯状细胞产生过量的黏液，黏液量过多长期聚集可阻塞气道，导致气流受限，引起通气功能障碍；黏液量过多影响纤毛清除和局部防御功能，若异物或病原菌滞留在肺和气道内，会增加呼吸道感染风险[7]。在本研究中哮喘模型小鼠肺组织中出现炎性反应、平滑肌细胞增厚、胶原沉积等现象，气道重塑是气道炎症、组织损伤等病理变化后出现的不正常修复，促使气道壁结构变化，包括气道上皮细胞损伤脱落、黏膜下层杯状细胞化生、平滑肌细胞增生和肥大、气道壁增厚等病理变化[8]。哮喘小鼠肺组织可能会增加气道重塑的风险；肺组织分泌更多的杯状细胞，而杯状细胞分泌黏液影响气道功能；BALF中细胞总数、嗜酸粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞数量均升高，哮喘小鼠出现病理损伤，涉及多种细胞参与，通过细胞水平参与气道黏液高分泌、气道重塑等生理病理过程[9]，哮喘小鼠病理性损伤，细胞均出现差异，加重疾病进程。

哮喘模型小鼠BALF中IL-6、TNF-α水平升高，而IL-6、TNF-α均是由单核细胞分泌的促炎因子，在气道炎症中参与炎性反应，促进炎症细胞的合成和炎症介质的释放[10]。IL-6分泌升高可促进嗜酸粒细胞的分泌，增加炎性反应和浆细胞释放免疫球蛋白，而免疫球蛋白可促进组胺、白三烯、血小板活化因子、前列腺素等过敏介质的释放，引起支气管痉挛，造成血管通透性和黏液分泌增加，造成黏膜水肿、增加气道重塑可能性，加重哮喘[11]。TNF-α调控细胞因子、黏液分子和黏液素等的分泌和表达，发挥促炎因子作用[12]。提示哮喘小鼠炎症因子分泌升高促进炎性反应，进而促进嗜酸性粒细胞、黏液分子、黏液素等的分泌，并促进过敏介质的释放，诱导气管痉挛，增加血管通透性促进气管重塑，增加黏液分泌导致气道黏液高分泌，诱导气流受阻同时增加呼吸道感染疾病风险。

哮喘模型小鼠肺组织中IRE1α、ATF6、CHOP、GRP78表达水平升高，ERS在生理病理情况下出现，会引起未折叠蛋白反应[13]，未折叠蛋白反应可参与跨膜蛋白IRE1α、ATF6、内质网激酶3条信号通路。正常状态下，这3条信号通路相关蛋白与CHOP、GRP78结合处于非激活状态[14]；在病理状态下，ERS可促进CHOP表达升高进而引起细胞代谢紊乱，导致细胞凋亡[15]。激活CHOP、GRP78可促进细胞外基质中胶原组织沉积进而基膜增厚，促进细胞代偿性恢复正常功能，加速气道重塑和气道狭窄[16-17]。上述研究提示，哮喘小鼠病理状态下IRE1α、ATF6、CHOP、GRP78处于激活状态，肺组织中ERS严重，此时未折叠蛋白参与跨膜蛋白信号通路反应，激活CHOP、GRP78蛋白表达，促进细胞外基质中胶原组织的大量沉积和基膜增厚，促进气道重塑，加速疾病严重。本研究结果显示，与模型组比较，ERS抑制剂组小鼠BALF中IL-6、TNF-α水平降低，可减轻细胞分泌过多的嗜酸粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞，抑制细胞外基质中胶原组织沉积和基膜增厚现象，实现对疾病的保护。在哮喘中抑制ERS对于缓解疾病具有重要意义。

综上所述，抑制ERS可降低气道黏液高分泌和气道重塑，实现对哮喘的保护。本文首次验证抑制ERS可保护哮喘，可为临床上哮喘的靶向治疗提供参考依据。但影响哮喘机制较复杂，进一步发现影响疾病因素对于缓解疾病意义重大，亦是本研究进一步研究重点。