促红细胞生成素对短肠综合征大鼠适应后期Hippo/YAP信号通路及干细胞分化的影响*

尹 光，孔文成，袁文琴，郑斯鑫，应荣超

(浙江大学医学院附属杭州市第一人民医院胃肠肛外科 310000)

短肠综合征(SBS)是指肠道恶性肿瘤等导致小肠需切除，通过切除小肠缓解原有疾病，但术后残肠小于200 cm，肠道对营养、液体和电解质的吸收减少，导致体重减轻、腹泻和营养不良等症状，影响机体健康[1]。残肠段若从肠功能衰竭中恢复过来，肠道黏膜吸收面积增加和对营养物质吸收增加，可防止肠衰竭，进而缓解疾病，是治疗的关键[2]。肠黏膜再生过程中包括多种细胞增殖、分化、凋亡过程，其中干细胞分化在受到外界刺激后，分化为具有特殊结构和功能的终末细胞，可修复并重建小肠黏膜上皮屏障，实现对肠道的保护[3]。因此，促进干细胞定向分化在缓解SBS中具有重要意义。促红细胞生成素(Epo)可诱导祖细胞增殖分化从而治疗疾病，且在临床上已用于治疗SBS[4-5]，但对干细胞影响尚未发现相关报道。Hippo/Yes相关蛋白(YAP)信号通路中YAP水平降低导致肠道再生受损，活化YAP可促进肠道再生[6]。推测Epo通过影响Hippo/YAP信号通路促进SBS大鼠适应后期干细胞分化，实现对SBS的保护。因此，剪去80%小肠建立SBS大鼠模型，观察Epo对SBS大鼠适应后期Hippo/YAP信号通路及干细胞分化的影响，可为临床提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物

SPF级大鼠28只，北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2018-0011，体重200～220 g。饲养条件：12 h/12 h光照/黑暗、(24±0.5)℃温度、(55±5)%湿度，自由饮水饮食。本研究经本院动物伦理委员会审核并批准。

1.1.2试剂与仪器

Epo购自成都地奥九泓制药厂(批准文号：国药准字S19991006，10 000 IU/mL)；苏木精-伊红(HE)染色试剂盒购自上海碧云天科技有限公司(货号：C0105)；阿利新蓝染液购自武汉赛维尔生物科技有限公司(货号：G1027)；一抗嗜铬粒蛋白、抗溶菌酶抗体、YAP、转录共激活因子PDZ结合基序(TAZ)均购自英国Abcam公司(货号分别为：ab15160、ab108508、ab205270、ab224239)。光学显微镜购自北京普瑞赛司仪器有限公司(型号：AxioL.A1)；蛋白凝胶成像仪购自上海天能科技有限公司(型号：4600)。

1.2 方法

1.2.1动物分组与造模

参考文献[7]建立SBS大鼠模型，1.0%戊巴比妥钠缓冲液腹腔注射麻醉大鼠，75%乙醇消毒擦拭皮肤，打开腹腔，剪去80%小肠，只留下约10 cm回肠末端和近端5 cm空肠，空肠6-0缝线缝合，用缝合线逐层缝合切口。手术后，将大鼠单独放置笼子，随意饮水，20只大鼠造模，造模成功16只，将其分为模型组、Epo组，每组8只。假手术组8只行肠横断再吻合，其余步骤相同。造模后7 d无症状，Epo组根据人与动物用药量换算[8]，隔日皮下注射157 U/kg Epo[5]，3次/周，持续2个月；其余两组注射等体积生理盐水。

1.2.2大鼠体重情况

分别在术前、术后7 d，药物治疗2个月后称量大鼠体重。

1.2.3HE染色观察肠道组织学情况

体重测量结束后，1.0%戊巴比妥钠缓冲液腹腔注射麻醉大鼠，剖开腹腔，将部分肠道置于4%多聚甲醛中固定，部分置于-80 ℃冰箱中保存待用。经石蜡包埋沿肠腔环形切片，部分切片HE染色，光学显微镜下观察和拍照，记录肠黏膜环状肌、纵肌厚度，绒毛长度、隐窝深度。

1.2.4阿利新蓝染色观察肠黏膜杯状细胞情况

部分切片常规脱蜡，阿利新蓝染液染色10 min，蒸馏水漂洗，0.5%中性红核染3 min。蒸馏水漂洗、乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片，显微镜下拍照观察。

1.2.5免疫组织化学(IHC)观察肠黏膜内分泌细胞、潘式细胞情况

部分切片经脱蜡、水化、抗原热修复等步骤后，滴加一抗嗜铬粒蛋白、抗溶菌酶抗体，4 ℃过夜后，加入对应二抗，苏木精复染，水洗、脱水、透明、封片。显微镜下拍照观察细胞形态。嗜铬粒蛋白阳性标志内分泌细胞、抗溶菌酶抗体阳性标志潘式细胞。细胞相对数量=该细胞数量/隐窝中细胞总数×100%。

1.2.6Western blot检测肠组织YAP、TAZ蛋白表达水平

取出-80 ℃保存的部分肠道组织，蛋白裂解液裂解提取肠组织总蛋白。凝胶电泳分离蛋白质、NC膜转膜、5%脱脂奶粉室温封闭1 h，对应加入一抗YAP、TAZ、GAPDH，4 ℃孵育过夜；加入对应二抗室温孵育1 h。二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒避光显色，蛋白凝胶成像仪拍照和定量分析。目的蛋白相对表达水平=目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 3组大鼠一般情况

假手术组术后仅在第1天出现腹泻，之后恢复良好；模型组和Epo组在术后前3 d均出现大便不成形、腹泻情况。

2.2 3组大鼠手术前后体重比较

术前3组大鼠体重比较差异无统计学意义(P>0.05)。术后7 d，与假手术组比较，模型组、Epo组体重降低(P<0.05)。治疗2个月后，与假手术组比较，模型组体重降低(P<0.05)；与模型组比较，Epo组体重增加(P<0.05)，见表1。

表1 3组大鼠手术前后体重比较

2.3 3组大鼠肠黏膜形态比较

假手术组黏膜、黏膜下层、肌层层次清晰，黏膜上皮完整清晰；模型组黏膜腺体较多，出现细胞浸润现象；Epo组肌层层次较清晰、细胞浸润现象缓解。与假手术组比较，模型组、Epo组环状肌、纵肌厚度，绒毛长度、隐窝深度均增加(P<0.05)；与模型组比较，Epo组环状肌、纵肌厚度，绒毛长度、隐窝深度均增加(P<0.05)，见图1、表2。

图1 3组大鼠肠黏膜形态学情况

表2 3组大鼠肠黏膜相关指标比较

2.4 3组大鼠肠黏膜干细胞分化情况比较

与假手术组比较，模型组杯状细胞、潘式细胞相对数量降低(P<0.05)；与模型组比较，Epo组杯状细胞、潘式细胞相对数量升高(P<0.05)，见图2、表3。

表3 3组大鼠肠黏膜干细胞分化情况比较

图2 3组大鼠肠黏膜干细胞分化情况(IHC,×400)

2.5 3组大鼠肠组织YAP、TAZ蛋白水平比较

与假手术组比较，模型组YAP、TAZ蛋白水平降低(P<0.05)；与模型组比较，Epo组YAP、TAZ蛋白水平升高(P<0.05)，见图3、表4。

图3 大鼠肠组织YAP、TAZ蛋白表达水平

表4 3组大鼠肠组织YAP、TAZ蛋白水平比较

3 讨 论

SBS中肠黏膜受多种信号通路影响，持续经历增殖、分化和凋亡等过程。其中干细胞可分化为所有细胞，包括吸收性细胞(如肠上皮细胞)、分泌性细胞(杯状细胞、内分泌细胞、潘式细胞)[9]。分泌性细胞中促进杯状细胞生成可增加肠黏膜黏液量，减少共生细菌易位[10-11]；潘氏细胞分泌的防御素等抗微生物肽具有抵抗病原微生物、重塑肠道微生物群落、保护肠道干细胞等功能[12]。因此，促进干细胞分化可缓解SBS。Epo是一种含唾液酸的酸性糖蛋白激素，在肝硬化大鼠模型中术前Epo治疗可促进肝细胞再生，从而提高肝切除术后的生存率[13]；在大鼠肝缺血再灌注模型中Epo预处理，可减少小肠黏膜损伤和炎性反应，延缓上皮细胞坏死、炎症浸润、毛细血管出血等症状，从而减轻肠黏膜屏障损伤[14]。本研究发现，与假手术组比较，模型组大鼠出现腹泻、体重减轻症状，杯状细胞、潘式细胞相对数量下降；环状肌、纵肌厚度，绒毛长度、隐窝深度均增加，与冯登宇等[15]研究结果类似，提示SBS后虽然肠道自身出现适应性，通过增加环状肌、纵肌厚度，增加绒毛长度和隐窝深度缓解SBS对机体的损害，但肠道菌群紊乱严重，仍出现腹泻症状；干细胞分化受限，营养物质等吸收减少，机体自身调节能力有限，造成体重减轻，疾病加重。治疗2个月后，与模型组比较，Epo组体重增加(P<0.05)，杯状细胞、潘式细胞相对数量增加，环状肌、纵肌厚度，绒毛长度、隐窝深度均增加(P<0.05)。提示Epo可在自身调节基础上通过促进干细胞分化进一步增加环状肌、纵肌厚度，增加绒毛长度、隐窝深度，增加肠黏膜吸收面积和对营养物质吸收，从而实现对SBS大鼠的保护。

Hippo/YAP信号通路最初在研究果蝇组织生长中发现，异常表达表型与海马相似而命名[16]。上游机械信号、细胞应激、细胞极性等刺激可诱发Hippo信号通路发挥作用，Hippo信号通路中激酶级联反应可活化其他因子从而促进效应分子YAP/TAZ发挥作用，活化的YAP/TAZ与细胞质中14-3-3蛋白结合，YAP/TAZ滞留在细胞质中无法进入细胞核，而丧失辅助因子[17-18]。当Hippo信号通路被抑制时，YAP/TAZ无法活化或与下游因子结合，进而阻止YAP/TAZ发挥其作用[19]。同时Hippo/YAP-TAZ信号通路又不是独立的，与转化生长因子(TGF)超家族TGF-β/Smads，Wnt/β-链蛋白(β-Catenin)和表皮生长因子受体(EGFR)/丝裂原相关蛋白激酶等信号转导途径级联，共同调节细胞增殖、细胞分化等过程[20]。本研究发现，与假手术组比较，模型组肠组织YAP、TAZ蛋白水平降低，提示SBS大鼠肠道中可能由于菌群紊乱、炎症浸润、细胞坏死等现象，导致YAP、TAZ蛋白表达受到抑制，对肠道干细胞的分化作用减弱，干细胞分化受限，绒毛长度增长、隐窝深度变深受到限制，肠道黏膜吸收面积和对营养的吸收有限，从而加重疾病。与模型组比较，Epo组YAP、TAZ蛋白水平升高，提示Epo作用于机体后，可缓解YAP、TAZ蛋白减少现象，高表达YAP、TAZ蛋白促进干细胞分化，增加肠道黏膜面积，实现对疾病的保护。

综上所述，Epo可激活Hippo/YAP信号通路，促进干细胞分化，实现对SBS大鼠的保护。但Hippo/YAP下游信号通路众多，具体通过哪些下游信号通路调控干细胞分化尚不清楚，还有待进一步研究。