非小细胞肺癌miRNA-191启动子区甲基化状态及其临床病理特征的相关分析*

徐 谊，徐 祥，王守峰，杨日荣，茅乃权，潘 泓

(广西医科大学附属肿瘤医院胸瘤外科，南宁 530021)

微小RNA(miRNA)是长度约为22个核苷酸的非编码内源性小RNA，在转录后水平与靶mRNA的3′UTR(untranslated region)结合，是肿瘤基础研究领域的热门话题[1]。miRNA-191与肿瘤的关系也日益受到学者的重视，其定位于人类染色体 3p21.31，在多种肿瘤中存在不同程度的高表达，miRNA-191作为一种潜在的疾病标志物和治疗靶点正日益受到关注[2-3]。但是关于miRNA-191启动子区甲基化状态的研究还鲜有报道，本研究旨在探讨非小细胞肺癌(NSCLC)miRNA-191启动子区甲基化状态及其与临床病理特征间的关系，为进一步证实miRNA-191在NSCLC发生、发展过程中的意义奠定基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2014年2月至2016年11月在本院手术切除的NSCLC肿瘤标本105份及对应距肿瘤组织边缘大于或等于5 cm的癌旁组织105份，所获标本均符合以下要求：(1)术后经组织病理学确诊为NSCLC；(2)术前未行放疗、化疗及免疫治疗；(3)患者及家属均理解并签署知情同意书；(4)标本离体后即刻置于液氮中，迅速转移至-80 ℃的冰箱中保存。病例的纳入标准：(1)患者的姓名、年龄、性别、组织类型、TNM分期、组织分化程度、生存时间等个人资料及临床病理资料完整；(2)患者术后病理标本均经过病理学专家确诊为NSCLC；(3)按照WHO国际组织学分类标准进行分期。本研究已通过广西医科大学附属肿瘤医院伦理委员会的审查批准。

1.2 方法

1.2.1试验主要试剂

实验主要试剂DNA提取试剂盒购自美国Omega Bio-Tek公司，EZ DNA Methylation-DirectTMKit购自美国ZYMO RESEARCH公司，Taq酶、PCR buffer等购自日本TAKARA公司。

1.2.2组织DNA提取

先用液氮研磨肿瘤及癌旁肺组织，然后依据Omega DNA提取试剂盒说明书中的顺序提取DNA，再用琼脂糖电泳检测DNA纯度，同时采用紫外分光光度计进行定量。

1.2.3DNA亚硫酸氢盐修饰及回收

DNA的亚硫酸盐修饰按照EZ DNA Methylation-DirectTMKit(ZYMO RESEARCH)的说明书，在PCR仪上进行，修饰条件：98 ℃ 8 min，64 ℃ 3.5 h，4 ℃储存20 h。按照试剂盒的纯化试剂说明书对修饰完成后的DNA进行纯化，再放于-20 ℃的冰箱保存备用。

1.2.4miRNA-191启动子查找及甲基化特异性PCR(MSP)引物设计

运用UCSC数据库预测人 miRNA-191启动子序列，提取启动子上游2 kb区域。MethPrimer在线分析网站用于分析和预测miRNA-191启动子的甲基化CpG岛，并设计引物，由广西南宁澳利可生物科技有限公司合成特异性甲基化引物和非甲基化引物。

1.2.5MSP

(1)MSP巣式PCR第一步引物及循环条件。上游引物：5′-ATT TTT TTT AGG GTT TTA GAG ATG G-3′，下游引物：5′-CCA CCT CCC CTT CTA TTA TTC T-3′，目的条带为221 bp。94 ℃预变性1 min，94 ℃变性5 s，63 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，5个循环；94 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，5个循环；94 ℃ 变性5 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，20个循环。(2)巣式PCR第二步引物及循环条件。甲基化上游引物：5′-TAT TTG GGT TAG GGC GTT GTT TAG G-3′，甲基化下游引物：5′-CAA CTA TTA TCT CCA AAA CAT TCC A-3′，目的条带为82 bp；非甲基化上游引物：5′-TAT TTG GGT TAG GGT GTT GTT TAG G-3′，非甲基化下游引物：5′-CAA CTA TTA TCT CCA AAA CAT TCC A-3′，目的条带为82 bp。94 ℃预变性1 min，94 ℃变性5 s，63 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，5个循环；94 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，5个循环；94 ℃变性5 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，25个循环。

1.2.6PCR产物电泳

在电泳槽中放入2%琼脂糖凝胶，并添加TAE缓冲液，直到液面比凝胶表面高1～2 mm。将PCR产物加入凝胶样品孔，电压设为100 V，电泳时间20 min，于紫外线灯下观察具体的电脉情况。

1.2.7结果判定

用甲基化引物和非甲基化引物扩增肺癌组织和癌旁组织，如果基因发生甲基化，则用甲基化引物扩增出的DNA产物将产生相应的甲基化目标条带；若基因未出现甲基化，则非甲基化引物扩增出相应的非甲基化目标条带。根据miRNA-191启动子区的甲基化状态将患者分为甲基化组和非甲基化组，采用Kaplan-Meier分析患者的预后。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 肺癌患者的基线资料

105例患者中，男76例，女29例；其中鳞癌69例，腺癌36例；低、未分化者82例，高、中分化者23例；TNM分期中，Ⅰ+Ⅱ期89例，Ⅲ+Ⅳ期16例。

2.2 筛选出合适的引物

运用UCSC数据库预测人 miRNA-191启动子序列，提取启动子上游2 kb区域。MethPrimer网站分析和预测人miRNA-191启动子区的甲基化CpG岛(图1)，根据结果，共设计出7对甲基化特异性引物和非甲基化引物，同时筛选出合适的引物。

图1 miRNA-191启动子区CpG岛的预测及各CpG位点(阴影部分为CpG岛)

2.3 MSP检测miRNA-191启动子区的甲基化水平

对癌旁组织及肺癌组织的DNA进行亚硫酸盐修饰后再行PCR扩展，结果显示，在105份癌旁组织标本中共有87份发生甲基化，甲基化率为82.86%；在105份肿瘤组织中共有48份发生甲基化，甲基化率为45.71%。癌旁组织与肺癌组织的miRNA-191启动子甲基化率比较，差异有统计学意义(χ2=37.87，P<0.01)。miRNA-191启动子MSP电泳图，见图2。

T：肺癌组织；N：癌旁肺组织；M：甲基化引物；U：非甲基化引物。

2.4 NSCLC组织中miRNA-191启动子甲基化水平及其与临床病理特征间的相关性分析

对NSCLC患者甲基化组和非甲基化组的miRNA-191启动子甲基化水平与患者的年龄、性别、肿瘤组织分化程度、组织类型、TNM分期等临床病理特征间的相关性分析结果显示，肺癌组织miRNA-191启动子甲基化率与癌组织的细胞分化程度及TNM分期相关，非甲基化组比甲基化组的分化程度更低(χ2=6.75，P=0.01)，且非甲基化组NSCLC患者TNM分期更晚(χ2=4.27，P=0.04)。但miRNA-191启动子区的甲基化状态与患者的性别、年龄及肺癌组织学类型等无明显相关性(P>0.05)，见表1。

表1 miRNA-191启动子甲基化状态与临床病理特性的关系[n(%)]

2.5 NSCLC患者miRNA-191启动子甲基化状态和患者预后的相关性分析

Kaplan-Meier分析结果显示，miRNA-191启动子区甲基化组患者的总生存期明显高于非甲基化组患者(χ2=6.06，P=0.01)，见图3。

图3 NSCLC患者miRNA-191启动子甲基化状态与OS的Kaplan-Meier分析图

3 讨 论

NSCLC约占所有肺癌类型的80%，且发病率和病死率逐年上升。有研究表明，表观遗传和细胞内遗传的异常改变是造成人类恶性肿瘤细胞产生的主要因素[4]。表观遗传学的改变不仅发生在恶性肿瘤的早期阶段，还在肿瘤的发生、发展过程中发挥重要作用，而DNA甲基化的研究是表观遗传学的重要内容[5-6]。近年来，对miRNA的甲基化研究逐渐深入后发现，许多miRNA启动子区的异常甲基化状态是某些癌基因及抑癌基因的“调控开关”，启动子区的高度甲基化会使基因的表达降低,而去甲基化则可以使被沉默的基因恢复表达[7-8]。 对miRNA-191的研究是当今细胞生物学领域的热点，有研究指出，miRNA-191在肿瘤的增殖与迁移中起着重要的作用[9-11]。随着研究的进一步深入，众多学者开始探索miRNA-191在癌症发生、发展中的机制，但其具体机制尚不清楚。XU等[12]研究报道，miRNA-191的过表达能促进上皮间质转化(EMT)和癌症干细胞(CSC)增殖迁移，同时具有促进细胞间质化并抑制细胞分化的能力，并且可以诱导癌症的发生和促进癌症细胞的早期转移。LIU等[13]研究报道，miRNA-191还可以诱导H1299和A549两个细胞系对放射产生抗拒作用。在肝癌的研究中也有报道，miRNA-191高表达可以预测肝癌患者的预后不良[14]。有研究发现，miRNA的甲基化改变会影响miRNA的表达，可能导致下游的增殖或者凋亡相关的癌蛋白异常表达，从而影响肿瘤的发生、发展[15-16]。目前，尚鲜有关于miRNA-191启动区甲基化状态对miRNA-191表达影响的报道。因此，研究癌症发生、发展过程中miRNA-191基因启动子甲基化状态的改变及其影响，对探明肿瘤的发生机制，具有非常重要的意义。

目前，关于NSCLC中基因启动子区的甲基化研究很多，但关于miRNA的相对较少，多在miRNA-137、miRNA-34b/c、miRNA-196a等的启动子区甲基化水平的研究中，且证明与miRNA的表达及肺癌的恶性程度有关[17]。本研究结果显示，NSCLC肿瘤组织的甲基化率明显低于癌旁正常肺组织，并且相较甲基化组的患者，非甲基化组的肿瘤具有组织分化程度低、TNM分期晚、预后差的特点。提示非甲基化状态可能参与肿瘤增殖转移过程,并影响预后。本课题组前期研究发现，沉默肺癌A549细胞的miRNA-191后，通过划痕实验和Transwell实验可发现肺癌A549细胞的迁移能力减弱，同时也证实了miRNA-191高表达与NSCLC患者的不良预后有关[18]。本课题组一直关注NSCLC中miRNA-191表达上调的原因，通过在生物信息学网站的分析，发现miRNA-191启动子区有丰富CPG岛，甲基化的异常通常都发生在CPG岛，与癌症的发展密切相关。同时，通过TCGA数据库可以发现，miRNA-191启动子区有甲基化水平明显降低的位点，表明miRNA-191启动子区甲基化异常，与此次试验结果相符合。提示miRNA-191启动子区的低甲基化水平可能是导致miRNA-191高表达的关键因素，本课题组将在后续的研究中进一步验证。

本研究结果表明，NSCLC患者的miRNA-191启动子区存在异常甲基化，并且其甲基化状态与患者临床病理特征关系密切，有望成为判断NSCLC预后的候选指标。