非小细胞肺癌中ERCC1与PD-1的表达及其临床意义

滕华，李影，何严璐琦，张洪珍

（1.华北理工大学附属河北省人民医院，河北 石家庄 050051；2.河北北方学院附属河北省人民医院，河北 石家庄 050051；3.河北省人民医院肿瘤五科，河北 石家庄 050051）

0 引言

肺癌是目前全球范围内常见恶性肿瘤之一，成为肿瘤相关死亡的重要原因[1]。在我国，肺癌的发病率和死亡率均处于恶性肿瘤前列[2]。肺癌中大约85%是非小细胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer，NSCLC)，传统意义上，手术提供了最好的治愈机会，但不幸的是，切除率常低至25%-30%[3]。超过60%的肺癌患者在诊断时就已经处于局部晚期或出现远处转移，此时无手术切除的可能，化疗和放疗则成为肺癌患者的主要治疗手段[4]，但传统的放化疗治疗效果有限，目前临床治疗上需要面对的挑战依然十分严峻。

切除修复交叉互补基因1 (Excision Repair Cross Complementing 1，ERCC1)存在于人染色体19q13.2～13.3, 全长15kb, 包含10个外显子, 编码中含有297个氨基酸蛋白质, 其主要功能为参与DNA链的切割和损伤修复，与肿瘤的发生发展及预后等密切相关[5]；程序性死亡受体1( Programmed Death-1，PD-1)是一种免疫抑制分子，在T细胞、B细胞、活化的单核细胞等均有表达，当其与相应配体结合后，可产生免疫抑制信号，促进肿瘤的发生和转移[6]；ERCC1和PD-1广泛存在于许多恶性肿瘤之中[7,8]。目前在NSCLC关于ERCC1和PD-1的相关性研究较少，本研究主要讨论在NSCLC中ERCC1与PD-1的表达情况及相关性，并分析其与患者临床病理特征之间的联系及预后关系，进而阐明其对NSCLC发生发展所产生的影响及临床意义。

1 材料和方法

1.1 材料

收集我院2014年1月至2015年12月经手术切除并由病理科确诊的98例NSCLC石蜡标本和30例癌旁正常肺组织(距离肿瘤组织切缘＞5㎝)石蜡标本。所选病例为初治患者，术前未接受抗肿瘤等相关治疗，且随访资料完整。男性51例，女性47例；年龄38-80岁，中位年龄61岁，其中≤60岁45例，＞60岁53例；腺癌59例，鳞癌39例；低-中分化52例，高分化46例；淋巴结转移者36例，无淋巴结转移者62例；根据美国癌症委员会(AJCC)第八版TNM分期标准进行分期：Ⅰ期34例，Ⅱ期28例，Ⅲ期36例。生存时间规定为手术日期至死亡或末次随访时间。随访截止日期为2019年12月31日。

1.2 试剂

兔抗PD-1单克隆抗体、鼠抗人ERCC1单克隆抗体均购自美国Abcam公司；SP检测试剂盒、DAB显色试剂盒、二抗试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；其余所需试剂和实验仪器均由我院病理科提供。

1.3 方法

采用免疫组织化学法检测ERCC1及PD-1。目标蜡块切片5μm，经常规脱蜡水化后，进行高温抗原修复；以3%的过氧化氢温育20min灭活内源性过氧化物酶；滴加正常血清封闭液，室温温育30 min，除去多余液体；滴加一抗(鼠抗人ERCC1单抗、兔抗PD-1单抗)，放置一夜；次日取出，PBS液洗涤3次，每次5 min；滴加生物素化二抗，PBS液洗涤3次，每次5 min；滴加试剂SABC，PBS液洗涤3次，每次5 min；DAB显色5min；苏木素复染2min。乙醇脱水，二甲苯透明，吹风机吹干后中性树脂封片。阴性对照由PBS代替一抗(余操作步骤相同)。

1.4 免疫组化结果判定

1.4.1 PD-1结果判定

评分标准参照文献[9]标准，细胞膜或者细胞质中出现黄色或者棕黄色颗粒为阳性表达。按肿瘤阳性细胞百分比与细胞显色强度分别进行记分，采用半定量法进行评价：阳性细胞数分为＜1%计0分，1%～10%计1分，11%～50%计2分，51%～75%计3分，＞75%计4分；显色强度分为无显色计0分，浅黄色计1分，黄色计2分，棕黄色计3分。两项乘积＜3分为阴性，≥3分为阳性。

1.4.2 ERCC1结果判定

评分标准参照文献[8]标准，阳性细胞数分为无阳性细胞计为0，1%～9%计为0.1，10%～50%计为0.5，＞50%计为1.0。显色程度分为无显色计0分，淡黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分。两项乘积≥2认定为阳性，反之为阴性。

全部切片由我院2名病理科专业人员随机独立阅片后，取平均分。

1.5 统计学方法

采用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析。计数资料以n(%)表示，比较采用卡方检验。相关性检验采用Spearman等级相关。Kaplan-Meier法进行生存分析，Log-Rank法进行预后的单因素分析，多因素生存分析采用Cox风险比例回归模型。以α=0.05为检验标准，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ERCC1和PD-1在NSCLC组织和正常肺组织中的表达

ERCC1在NSCLC组织中的表达低于正常肺组织，差异有统计学意义(P＜0.05)；而PD-1在NSCLC组织中的表达高于正常肺组织，差异有统计学意义(P＜0.05)，详见表1。

表1 ERCC1、PD-1在肺癌标本和正常组织标本中的阳性表达率[n(%)]

2.2 ERCC1及PD-1的表达与临床病理的关系ERCC1阳性表达

在TNM分期为Ⅰ期～Ⅱ期的患者中显著升高，差异有统计学意义(P＜0.05)；PD-1阳性表达在有淋巴结转移和TNM分期为Ⅲ期的患者中显著升高，差异有统计学意义(P＜0.05)；二者表达均与性别、年龄、病理类型、分化程度无关(P＞0.05)，详见表2。

表2 ERCC1及PD-1的表达与临床病理特征的关系[n(%)]

2.3 ERCC1和PD-1的表达与预后的关系

ERCC1阳性表达组的5年生存率为30.60%，中位生存期为45.0个月；阴性组的5年生存率为14.30%，中位生存期为29.0个月；两组间生存率的比较差异有统计学意义（χ2=6.013，P=0.014）（图1）。PD-1阳性表达组的5年生存率为11.10%，中位生存期为28.0个月；阴性组的5年生存率为29.00%，中位生存期为40.0个月；两组间生存率的比较差异有统计学意（χ2=7.147，P=0.008）（图2）。

图1 ERCC1阳性组与阴性组的生存曲线

图2 PD-1阳性组与阴性组的生存曲线

经Cox多因素分析，结果显示：仅TNM分期（P=0.011，95%CI:1.203-4.092，RR=2.219）和淋巴结转移（P=0.043，95%CI:1.020-3.157，RR=1.794）是影响预后的独立危险因素；ERCC1和PD-1的表达并非预后的独立危险因素，详见表3。

表3 影响NSCLC预后Cox多因素分析

2.4 NSCLC组织中ERCC1及PD-1表达的相关性

49例ERCC1阳性表达中，有19例PD-1阳性表达；49例ERCC1阴性表达中，有32例PD-1阴性表达，详见表4。Spearman等级相关性分析结果显示，ERCC1和PD-1在NSCLC中的表达无明显相关性（rs=0.042，P＞0.05）。（表4）

表4 ERCC1及PD-1在NSCLC组织中表达的相关性(n)

3 讨论

肺癌作为常见的恶性肿瘤之一，已经严重威胁到人类的健康[1,2]。2015年Chen等[2]基于中国恶性肿瘤现状大数据指出，肺癌是引起男性和女性癌症死亡的五大原因之一，其中肺癌的发病率占男性恶性肿瘤之首，而在女性恶性肿瘤中仅次于乳腺癌。在科学技术日新月异的年代，肺癌的治疗已经进入到个体化治疗阶段，本研究通过联合检测ERCC1和PD-1，企图从基因环境和免疫微环境两方面来探讨肿瘤的发生与发展，为NSCLC的治疗提供参考意义。

ERCC1是核苷酸切除修复过程中的限速酶，也是DNA修复基因家族中的重要成员之一，ERCC1 mRNA的低表达提示核苷酸切除修复能力降低，导致肺癌发病风险增加[10]，高水平表达与顺铂制剂耐药有关[11]。目前对于ERCC1与临床病理特征的关系报道尚无定论。Ota S等[12]研究显示，ERCC1的表达与性别、年龄、吸烟情况、病理分期无关，而与病理类型有关。Deng等[13]报道ERCC1在癌组织和癌旁组织的表达，与性别、年龄、吸烟情况、病理类型无关，与肿瘤TNM分期有关，与本研究结果相近。近年来有关ERCC1与肺癌预后关系的说法不一，多数研究认为NSCLC早期患者，ERCC1是预后良好的指标，其高表达有利于延长生存时间，而晚期患者，ERCC1影响化疗导致耐药，其高表达往往降低生存期[5,8,12,13]。本研究结果提示ERCC1阳性患者的预后好于阴性患者，且与生存显著相关，考虑与病例大多为早期患者有关。多因素分析显示ERCC1不是影响预后的独立因素，但进一步亚组分析显示I～II期ERCC1阳性表达者的生存趋势好于Ⅲ期ERCC1阳性表达者(P＜0.05)。

PD-1多存在于活化的T细胞表面, 与配体PD-L1结合后会抑制相关细胞因子的分泌，从而发挥免疫自身稳定功能, 阻止免疫激活造成的机体损伤，这也成为肿瘤细胞发生免疫逃逸的主要机制之一[14]。目前研究发现，PD-1在肝癌、食管癌、肺癌、乳腺癌、胃癌等多种恶性肿瘤中呈高表达状态[15-17]。有报道[18]表明PD-1在NSCLC组织中的高表达状态与患者的临床病理特征及无进展生存期无关。Yin等[19]研究发现，PD-1的表达与吸烟情况、淋巴结转移有关，并且其与预后相关，阳性表达者生存期短，预后差。本研究结果显示PD-1在癌组织和癌旁组织中的表达，与淋巴结转移及TNM分期有关，PD-1阴性患者的5年生存率及中位生存期好于阳性患者，但PD-1不是影响预后的独立因素，这一结果与Yin等[19]研究结果相符。

肺癌的发生十分复杂，目前普遍认为它是一个多重因素参与并经历多个发展阶段的疾病，是个体遗传因素和环境危险因素相互作用的结果。ERCC1作为基因修复过程中的重要因素, 成为研究热点，而PD-1是免疫治疗与肿瘤微环境中重点研究对象。本研究探讨了ERCC1和PD-1的相关性，发现二者并无关联，目前对于ERCC1和PD-1共表达的研究尚少，还需更多的研究验证二者关系。

综上所述，ERCC1和PD-1在NSCLC组织中均有不同程度的表达，联合检测癌组织中ERCC1和PD-1对NSCLC早期诊断和精准化、个体化治疗具有重要意义。