基于核磁共振技术比较四川产厚朴根皮与干皮水提冻干粉的化学成分

韩君 李厚聪 张志锋

【摘 要】 目的：基于核磁共振技术比较四川产厚朴根皮与干皮水提冻干粉的化学成分。方法：對四川产厚朴根皮与干皮水提冻干粉进行红外吸收光谱（IR）、紫外吸收光谱（UV）及核磁共振（NMR）波谱（包括1H NMR、13C NMR、1H-1H COSY、1H-13C HSQC）进行测定。结果：分析其UV和IR谱图特征吸收峰对应的基团，并对其1H NMR和13CNMR信号进行了归属，分析了其化学成分。结论：该研究将为厚朴的其它相关研究提供参考。

【关键词】 厚朴;核磁共振（NMR）;红外吸收光谱（IR）;紫外吸收光谱（UV）;1H-1H COSY;1H-13C HSQC

Abstract：Objective Comparison of Chemical Components of Water-Extracted Freeze-dried Powder of Root Bark and Stem Bark of Mangnolia Officinalis Produced in Sichuan based on Nuclear Magnetic Resonance.Method The water-extracted freeze-dried powder of magnolia officinalis root bark and stem bark produced in Sichuan will be measured with infrared absorption spectrum（IR）， ultraviolet absorption spectrum （UV） and nuclear paramagnetic resonance spectrum （NMR） （including 1H NMR，13C NMR，1H-1H COSY，1H-13C HSQC） in this paper.Result To analyze their groups corresponding to characteristic absorption peak of UV and IR spectrogram， classify their 1H and 13CNMR signals and analyze their chemical components.Conclusion The research will provide a reference for other relevant studies of magnoliae officinalis.

Keywords：Magnolia officinalis Rehd. et Wils.; NMR; IR; UV; 1H-1H COSY; 1H-13C HSQC

厚朴药材规格等级标准中，按来源将厚朴划分为温朴和川朴2种，按取皮部位再划分为4种规格筒朴、蔸朴、根朴、枝朴，每一种规格又按长度和质量划分一等、二等、三等、四等若干等级[1-2]。厚朴规格等级划分主要是以性状特征、特征图谱、挥发性成分和非挥发性化学成分差异为依据[3]，然而特征图谱需要大量标准品以及现有研究缺少对厚朴相关化合物的多级质谱裂解途径及其规律的研究，操作性不强，挥发性成分由于其成分复杂， 其中性质相似的组分保留时间较为接近， 色谱峰重叠严重， 较难准确定性和定量[4];依据性状特征划分商品规格等级，这种方法是否有科学内涵又值得商榷[5]。

核磁共振技术（NMR）具有良好的分析复杂成分的能力，近年来广泛应用于代谢组学和复杂成分分析，并取得了良好的效果[6-8]，其中有少数文献报道采用一维NMR光谱对厚朴进行相关研究[9]，但一维NMR方法谱峰分离不佳谱图上识别不了更多的化学基团，二维NMR谱除了包含一维NMR谱中的信息，还含有更多的结构信息[10]。本研究应用核磁共振技术1HNMR、13CNMR、1H-1H COSY、1H-13C HSQC对四川产厚朴根皮和干皮水提冻干粉进行化学成分分析，弥补了化学分析中特征图谱需要大量标准品以及现有研究缺少对厚朴相关化合物的多级质谱的裂解途径及其规律的研究。临床中厚朴入药的形式多为水煎煮汤剂，故本研究对水提物化学成分进行研究。

1 材料与方法

1.1 仪器设备与软件

Bruker AVANCEII 500MHz超导脉冲傅里叶变换核磁共振波谱仪（瑞士布鲁克公司），5mm核磁管（美国Norell公司）;台式高速离心机（德国Sigma公司）;BSA124S型电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）;UV-2550紫外可见分光光度计（日本岛津公司）;Spectrum Two FI-IR Spectrometer（PerkinEImer公司）;NMR谱图通过Bruker Topspin 4.0.8及MestReNova 9.0.1软件处理。

1.2 材料与试剂 收集四川省共8份厚朴样本，由西南民族大学张志锋教授鉴定为木兰科植物厚朴Magnolia officinalis Rehd. et Wils.，详细信息见表1;氘代二甲基亚砜 （DMSO-d6）购自美国CIL公司。

1.3 方法

1.3.1 样品制备 称取厚朴样品60g置于圆底烧瓶中加水1000mL，加热回流1h，提取液于65℃减压浓缩，浓缩液冷冻干燥，取固体粉末10mg至NMR样品管中，加入氘代二甲基亚砜0.6mL溶解，3500r/min离心5min，移液枪取上清液转移至NMR样品管中用于实验。

1.3.2 NMR实验条件1H和13C-NMR的工作频率分别为500.13和125.95MHz，实验温度为25℃，谱宽分别为12376.24和35971.22Hz。1H-1H COSY和1H-13C HSQC实验分别采用COSYGPMFQF和HSQCEDETGPSI标准脉冲程序。1H-1H COSY的F2维（1H）和F1维（1H）谱宽均为5000Hz，采样数据点阵t2×t1=2048×256，累加次数为16;HSQC的F2维（1H）和F1维（13C）谱宽分别为5000Hz和25155Hz，采样数据点阵t2×t1=1024×256，累加次数为16[11]。NMR谱图通过Bruker Topspin 4.0.8及MestReNova 9.0.1软件处理。

2 结果与分析

2.1 厚朴根皮水提冻干粉的UV与IR分析 厚朴根皮水提物的紫外吸收光谱的谱图上（图1）可以清晰见到两个吸收带，205nm为强吸收带（K带），是分子中共轭烯烃的吸收带，属于π→π*跃迁。284nm为弱吸收带（R带），是分子中羰基的吸收带，属于n→π*跃迁。红外吸收光谱在波数3381、1075cm-1处有吸收，表明样品分子中含有羟基;在波数2932、1413cm-1处有吸收，表明样品分子中含有亚甲基和甲基;在波数1608cm-1处有吸收，表明样品分子中含有羰基基团;在波数1506、914cm-1处有吸收，表明样品分子中含有烯烃;在波数1270、1230cm-1处有吸收，表明样品分子中含有醚键;在波数820cm-1处有吸收，表明样品分子中含有苯环;3150～3260cm-1区间应该还有一个vC=C-H烯烃碳氢的伸缩振动;在990cm-1附近未出现一个明显的端烯的特征峰，从该谱图推知（图2），含有magnoloside B类似物的特征峰，同样也含有厚朴酚类似物的羟基、烯烃、亚甲基、苯环等特征峰。

2.2 厚朴根皮水提冻干粉的NMR分析 根皮水提冻干粉的核磁测试溶剂：氘代DMSO-d6。它的核磁共振氢谱（图3）信号尽管比较复杂，但依然可辨相对主要的信号。它的氢谱在芳香区域显示一组典型的1，2，4-三取代苯环信号：6.93 （2H， m）、6.79 （1H， d， J=8.8 Hz），在烯烃信号区域检测到一组乙烯基：5.93 （1H， m）、5.06 （1H，br d，J=17.0Hz）、5.00 （1H， br d， J=10.0Hz），此外在高场区检测到一个积分值为两个氢的宽双峰信号：3.27 （2H， br d， J=6.7Hz）。它的碳谱（图4）也检测到一系列信号，借助二维核磁HSQC信号（图5），可辨识高场区一个亚甲基碳信号：38.7;源于乙烯基的两个碳：115.1、138.2;苯环上的三个次甲基碳：115.9、127.8、131.1。在二维核磁1H，1H-COSY谱中（图6），观察到高场处的那个亚甲基双峰信号与乙烯基氢信号均有相关，以及苯环上由于3J耦合而产生的相关信号。基于上述一维、二维核磁图谱的仔细分析，可得出该结构中含有苯丙素结构单元，考虑到厚朴已报道化学成分的结构特点，提示该结构存在对称因素——即完全对称的苯丙素二聚体，调研相关文献中的核磁数据，最终确定上述核磁信号与厚朴酚结构（1）（图7）是吻合的。

此外，在氢谱中还检测到一组微量的、但是可以辨识的反式烯氢信号：6.30 （1H， d， J=15.8Hz）、7.47 （1H， d， J=15.8Hz），提示很可能来源于肉桂酰基片段;在高场区可见双峰甲基信号：1.12 （3H， d， J=6.0Hz），借助HSQC谱可知该甲基的碳信号位于17.8ppm，在1H，1H-COSY谱观察到该甲基双峰与3.77的连氧氢信号有耦合，提示微量成分中很可能含有鼠李糖片段。在氢谱的3.0～4.0ppm、碳谱的60～85ppm区间可见若干来源于糖上的信号，氢碳谱的芳香区也有若干信号，考虑到厚朴已报道化学成分的结构特点，调研相关文献中的核磁数据，推测根皮水提冻干粉中还含有微量的苯乙醇苷类成分，如magnoloside A、magnoloside B。但由于在提取物中的占比相对微量，尚不能做到准确的定性。

四川产厚朴根皮水提冻干粉的主要成分是厚朴酚，微量成分为苯乙醇苷类。

2.3 厚朴干皮水提冻干粉的UV与IR分析 厚朴干皮水提取的紫外吸收光谱的谱图上（图1）可以清晰见到三个吸收带，204nm为强吸收带（K带），是分子中共轭烯烃的吸收带，属于π→π*跃迁。284nm为弱吸收带（R带），是分子中羰基的吸收带，属于n→π*跃迁。322nm为弱吸收带（R带），是分子中共轭羰基的吸收带，共轭结构使能量下降，吸收光发生了红移，属于n→π*跃迁。红外吸收光谱在波数3393、1074cm-1处有吸收，表明样品分子中含有羟基;在波数2934、1418cm-1处有吸收，表明样品分子中含有亚甲基和甲基;在波数1607cm-1处有吸收，表明样品分子中含有羰基基团;在波数1516cm-1处有吸收，表明样品分子中含有烯烃;在波数1269cm-1处有吸收，表明样品分子中含有醚键;在波数814cm-1处有吸收，表明样品分子中含有苯环。该红外谱图中同样能在3150～3260cm-1区间观察到一个被掩盖掉的强吸收峰，在990cm-1附近细看可隐约观察到一个待出的的端烯峰，从该谱图（图2）推知，含有magnoloside B类似物的特征峰，同样也含有厚朴酚类似物的羟基，烯烃，亚甲基，苯环等特征峰以及隐约的端烯峰，因此该谱图应含有magnoloside B及厚朴酚类似物。

2.4 厚朴干皮水提冻干粉的NMR分析 干皮水提冻干粉的核磁测试溶剂：氘代DMSO-d6。在氢谱（图3）中检测到一组特征性的反式烯氢信号：6.30 （1H， d， J=15.8Hz）、7.47 （1H， d， J=15.8Hz），在6.55～7.15ppm区间可见多组苯环的1，2，4-三取代芳氢信号，在3.6～4.0ppm未见芳甲醚信号，可推断上述信号来源于咖啡酰基片段;在高场区检测到双峰甲基信号：1.12 （3H， d， J=6.0Hz），借助HSQC谱（图5）确定该甲基的碳信号位于17.7ppm，在1H，1H-COSY谱（图6）观察到该甲基双峰与3.78的连氧氢信号有耦合，提示了鼠李糖片段的存在。在氢谱的2.63ppm处检测到连苯环的亚甲基信號，通过HSQC谱确定该亚甲基的碳信号位于35.1ppm，在1H，1H-COSY谱中观察到该亚甲基氢与3.52/3.80处有相关，可初步推断为苯乙醇苷类。在氢谱的5.53ppm处检测到一个耦合常数为2.9Hz的三重峰，这是吡喃阿洛糖C-3位氢的诊断性信号，大幅度低场位移提示了阿洛糖的C-3位羟基与咖啡酸成酯。此外，在4.0～5.0ppm区间可见多个阿洛糖端基氢、葡萄糖端基氢以及鼠李糖端基氢信号，前两者为耦合接近8Hz的双峰，后者呈现宽单峰，在氢谱的3.0～4.0ppm、碳谱的60～85ppm区间可见若干来源于糖上的信号。考虑到厚朴已报道化学成分的结构特点，调研相关文献中的核磁数据，可确定干皮水提冻干粉中富含苯乙醇苷类成分，如magnoloside A、magnoloside B或它们的结构类似物。由于该类成分的核磁信号异常复杂，又是多个类似结构的混合物，未能确定具体的苯乙醇苷类成分的化学结构。

此外，它的核磁共振氫谱中在烯烃信号区域依稀可辨一组乙烯基：5.93 （1H， m）、5.06 （1H， br d， J=17.0Hz）、5.00 （1H， br d， J=10.0Hz），这是厚朴酚的特征性信号。尽管信号非常微弱，但对它的结构定性是可靠的。

四川产厚朴干皮水提冻干粉富含苯乙醇苷类成分，此外依稀可见微量的厚朴酚。

2.5 四川产厚朴根皮和干皮水提冻干粉NMR变量数据差异性检验 选择SPSS软件对四川产厚朴根皮和干皮水提冻干粉NMR变量数据进行统计分析，采用平方欧式距离作为厚朴根皮和干皮间距离的计算方式。

由表2可知，P值为0.987，大于0.05，故根皮组内的的数据没有差异性。

由表3可知，P值为0.976，大于0.05，故干皮组内的的数据没有差异性。

由表4可知，在莱文方差等同性检验中，P值为0.134，大于0.05，所以选择等方差的数据。在平均值等同性t检验中，P值为0.012，小于0.05，所以可以认为根皮和干皮组之间存在差异。四川产厚朴根皮和干皮水提冻干粉聚类分析结果如图8所示。

3 讨论与结论

3.1 讨论 常规1H-NMR中水峰信号很强，溶剂信号虽然弱些，但相对于除水峰以外的其它信号仍然很大。上述信号不仅直接影响了对所处区域其它信号的观测，更主要是由于水峰和溶剂信号构成了核磁共振中自由衰减信号的主体，必然会抑制低浓度组分信号的信噪比改善[12]。

预饱和方法是所有压制水峰的方法中最方便，效果也最好的方法。针对样品的自身特殊性和实验的目的要求，确定了以双溶剂预饱和脉冲序列为获取1H-NMR图谱的技术手段，该脉冲序列具有对多组信号进行选择性压制功能[12]如图9所示。脉冲序列：RD-90°-t1-90°-tm-90°-FID参数：t1为2.4s、混合时间tm为100ms、谱宽10000Hz、累加次数为32。

3.2 结论 本实验对四川产厚朴根皮与干皮水提冻干粉进行红外吸收光谱（IR）、紫外吸收光谱（UV）及核磁共振（NMR）波谱（包括1H NMR、13C NMR、1H-1H COSY、1H-13C HSQC）进行了测定，分析了其UV和IR谱图特征吸收峰对应的基团，并对其1H NMR和13C NMR信号进行了归属，上述波谱学数据说明了四川产厚朴根皮水提冻干粉的主要成分是厚朴酚，微量成分为苯乙醇苷类，厚朴干皮水提冻干粉富含苯乙醇苷类成分，此外依稀可见微量的厚朴酚，其中水溶性成分苯乙醇苷被发现广泛存在于厚朴之中，并由于其突出的生物活性而引起了更多的关注，比如止痉挛的作用、酶抑制效果、抗氧化性[13]。值得注意的是，在早期研究中，苯乙醇苷和厚朴苷A均在胃肠功能障碍动物模型中均表现出明显的疗效[14]，这意味着苯乙醇苷可能有助于厚朴药材发挥临床效果。因此，明确了厚朴干皮与根皮生物活性成分差异，为合理选择厚朴不同药用部位作为原材料开发不同功效的药物提供参考。同时该研究为建立中药厚朴不同规格核磁共振化学信息提供参考资料，亦为中药厚朴规格等级标准制定提供基础资料。

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