７种傣药材不同极性提取物的抑菌作用对比研究

李晓花 李祯 台海川

【摘 要】 目的：研究7种傣药材不同极性溶剂提取物对大肠杆菌（Ec.）和绿脓假单胞菌（Pa.）的抑菌作用。方法：以乙酸乙酯、正丁醇依次萃取7种傣药材的95%乙醇提取物，获得不同极性部位;采用滤纸片法测定提取物的抑菌圈，二倍稀释法测定提取物及阳性药物的最低抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC），确定其抑菌活性。结果：25mg/mL浓度条件下，7种傣药材不同极性提取物均显示有不同程度抑菌效果，对大肠杆菌的抑菌圈为（1.21±0.04）～（2.80±0.07）cm，对绿脓假单胞菌的抑菌圈为（0.84±0.03）～（1.96±0.03）cm。其中勐腊大解药（平脉藤）乙酸乙酯萃取物（MLDJY-2）抑菌效果显著，对Ec.抑菌圈、MIC和MBC分别为（2.80±0.07）cm、0.195mg/mL和1.563mg/mL，對Pa.抑菌圈、MIC和MBC分别为（1.96±0.03）cm、0.781mg/mL和6.250mg/mL。结论：验证了7种临床常用傣药材抗菌活性，为临床应用和抑菌产品的开发提供一定的科学依据。

【关键词】 傣药材;提取物;抑菌圈;最小抑菌浓度;最低杀菌浓度

Abstract：Objective To study the antibacterial effects of different extracts of 7 kinds from Dai medicinal materials against E.coli（EC.） and Pseudomonas aeruginosa （Pa.）. Methods The 95% ethanol extracts of 7 kinds of Dai medicinal materials were extracted with ethyl acetate and n-butanol to obtain different polar fractions. The antibacterial zones were determined by filter paper method， and the minimum inhibitory concentration （MIC） and minimum bactericidal concentration （MBC） of the extracts and positive drug were determined by double dilution method. Results At the concentration of 25g/mL， the inhibitory zones againstE.C. And Pa. were from 1.21±0.04cm to 2.80±0.07cm and 0.84±0.03cm～1.96±0.03cm， respectively. Among them， the MLDJY-2 showed significant antibacterial activity. Inhibition zone agaist E.C.， MIC and MBC were 2.80±0.07cm， 0.195mg/mL and 1.563mg/mL， respectively. antibacterial zone against Pa.，MIC and MBC were 1.96±0.03cm， 0.781mg/mL and 6.250mg/mL， respectively. Conclusion The antibacterial activities of 7 kinds of Dai medicinal materials were verified， which provided scientific basis for clinical application and development of antibacterial chemical products.

Keywords：Dai Medicines; Extracts; Antibacterial Zones; MIC; MBC

感染性疾病是由病毒、衣原体、支原体、立克次体、细菌、螺旋体、真菌、寄生虫等致病微生物侵入人体导致的疾病，是危害人类健康的主要疾病[1]，临床常用抗生素治疗感染性疾病，具有杀菌抑菌和抗炎效果，但其毒性及滥用引起的二次感染及细菌的耐药性等问题已经成为全球性问题[2-3]。中药是我国传统医学发展的结晶，已经有多种中药临床用于感染性疾病的治疗，效果显著。中药治疗感染性疾病具有多靶点、抑菌谱广、毒副作用小、不易产生耐药性等特点，近年来引起越来越多学者关注[4]。傣医药是四大民族医药之一，具有2500多年的应用历史，其以“四塔”、“五蕴”为理论核心，具有独特和完整的理论体系，为傣族和边疆人民的繁衍生息作出了巨大贡献[5]。

本研究选取名老傣医林艳芳教授临床常用于感染性疾病治疗的7种傣药材，以大肠杆菌和绿脓假单胞菌作为指示菌，对选取的药材乙醇提取物用不同极性溶剂萃取，获得的提取物进行体外抑菌对比实验，为临床应用和产品开发提供依据。

1 材料

1.1 药材与试剂 白花臭牡丹根、栘皮、海船皮、勐腊大解药、藤甘草、野甘草、竹叶兰由云南雅解傣药堂科技有限公司提供，基源由林艳芳教授鉴定为各个药材饮片的干燥药用部位。

LB培养基（北京鼎国昌盛生物技术有限公司），琼脂（美国Invitrogen公司），葡萄糖（美国Sigma公司），琼脂粉（日本Japan公司），DMSO（美国Sigma公司）。

试剂均为分析纯。

1.2 供试菌种 菌种：绿脓假单胞菌（Pa.，博伟生物技术有限公司），大肠杆菌（Ec.，天津赛尔生物技术有限公司）。

1.3 仪器设备 流水式粉碎机（DF-35，温州大德），旋转蒸发仪（EV241，北京莱伯泰科仪器股份有限公司），恒温水浴锅（HWS-24，上海一恒科学仪器有限公司），电子天平（ME204，梅特勒-托利斯），鼓风干燥箱（BGZ-246，上海博迅实业有限公司），恒温摇床培养箱（ST20H，冠森生物科技上海公司），超净工作台（HCB-1300V，青岛海尔特种电器有限公司），高压灭菌锅（GI80TW，厦门致微仪器有限公司），台式离心机（L420，长沙湘仪离心机仪器有限公司）。

2 方法[6-8]

2.1 提取物和阳性对照药的制备 取7种傣药材，打粉过20目筛，备用。分别称取100g各种傣药材，加10倍量95%乙醇回流提取3次，每次2h，合并提取液减压浓缩至无醇。提取物加适量热水混悬后，放置至室温，依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，获得乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位。萃取物及编号见表1。

提取物溶液的配制：将各萃取物的水部分用超纯水溶解，母液浓度为250mg/mL，稀释至终浓度25mg/mL，0.22μm过滤器过滤除菌备用;乙酸乙酯和正丁醇萃取部位用0.2%的DMSO-水溶解，母液浓度为250mg/mL，稀释至终浓度25mg/mL，0.22μm过滤器过滤除菌备用。

阳性对照药的配制：准确称取25mg对羟基苯甲酸乙酯，溶1mL无水乙醇，制得25mg/mL对照品溶液，0.22μm过滤器过滤除菌备用。

2.2 试剂的配制

2.2.1 LB培养基的制备 10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、氯化钠10g，15g琼脂粉，加蒸馏水至950mL，混匀后，NaOH调pH至7.0，加水至1000mL，121℃高压20min。

2.2.2 营养胨培养基的制备 10g蛋白胨、3g牛肉膏、氯化钠5g，15g琼脂粉，加蒸馏水至950mL，混匀后，NaOH调pH至7.2～7.4，加水至1000mL，121℃高压20min。

2.2.3 菌液的制备 将4℃下保存的绿脓假单胞菌和大肠杆菌菌种，接种于营养琼脂培养基上，37℃孵育24h，挑取菌落至琼脂液体培养基，摇菌培养12h后，用生理盐水校正，与0.5麦氏比浊，将含菌量调至1.0×105cfu/mL。

2.2.4 含菌平板的制备 将15mL灭菌琼脂培养基倒入无菌培养皿制平板，待平板完全凝固冷却，取100μL稀释好的浓度1.0×105cfu/mL菌液至培养皿内，用无菌棒涂抹均匀，封口膜密封后放4℃冰箱备用。

2.3 滤纸片法测定抑菌圈 取灭菌双层圆形滤纸片（6mm），将滤纸浸在各样品溶剂中，设DMSO和纯水空白对照，对羟基甲酸乙酯阳性对照。取出滤纸片晾干，轻轻放在含菌平板的相应位置;贴好滤纸片的含菌平板倒置放入4℃冰箱静置2h后，置于恒温培养箱37℃培养24h;培养结束后，用精确度为1/10mm的游标卡尺十字交叉测量抑菌圈直径，實验结果取3个平行组的平均值。抑菌圈越大，表示抑菌效果越好。

2.4 二倍稀释法测定最小抑菌浓度（MIC） 采用试管等倍稀释法，量取1.0mL样品浓度为50mg/mL的溶液加入到第一支试管中，再加入1mL灭菌培养基;从第一支试管中取出1mL溶液，滴加到第二支试管中，依此类推至第九管。第10管含有2mL培养基，并弃去1mL;同时以1mL相同浓度的DMSO和纯水代替药物提取物与培养基混合做空白对照，相同浓度的对羟基苯甲酸乙酯为阳性对照;采用微量加样器向各试管中均加入制备好的菌悬液100μL（1×105cfu/mL），摇匀后放入培养箱中37℃培养24h，取出试管充分震荡混匀，并对各个试管进行检查，用肉眼观察期浑浊度，以此来判断有无菌生长;对照管中菌呈现浑浊状生长，溶液开始出现澄清的最低浓度确定为样品的MIC值。

2.5 最小杀菌浓度（MBC）的测定 自样品浓度高于MIC值（包括MIC浓度）的试管中各吸取100μL混悬液分别滴加到灭菌的平板培养基上，涂布均匀，培养箱中37℃培养24h，肉眼观察结果，菌落数小于5个或无菌落生长的最低样品浓度确定为MBC值。

2.6 统计分析 采用SPSS 19.0软件对实验数据进行统计学分析处理，每组数据3个重复，数据以均数加减标准差（x±s）表示，P<0. 05为差异具有统计学意义。

3 结果与分析

3.1 各提取物均具有抑制大肠杆菌和绿脓假单胞菌生长的活性 抑菌圈的检测是为了对比在同种浓度下不同提取物的抑菌活性大小，抑菌圈越大，说明抑菌活性越好。表2的检测结果显示：7种解药提取物的不同极性萃取部位均具有抑制大肠杆菌和绿脓假单胞菌的活性，抑菌圈检测结果显示，对绿脓假单胞菌抑制效果最好的为MLDJY-2，即勐腊大解药正丁醇萃取部位，抑菌圈为（2.80±0.07）cm，与阳性对照药效果相当;效果最差的为ZYL-3，即竹叶兰水部位，抑菌圈为（1.21±0.04）cm。

对大肠杆菌的抑菌圈检测结果显示：大部分萃取物均显示不同程度抑制绿脓假单胞菌生长的效果，抑菌圈直径测量结果显示，对铜绿假单胞菌抑菌效果最好的为MLDJY-2，即勐腊大解药乙酸乙酯萃取物，抑菌圈为（1.96±0.03）cm，其次为DY-1，即栘乙酸乙酯萃取物，抑菌圈为（1.93±0.10）cm。

3.2 最小抑菌浓度（MIC）的测定 最小抑菌浓度是指在特定环境下孵育24h，可抑制某种微生物出现明显增长的最低药物浓度，试验时肉眼未见细菌生长的最低药物浓度即为MIC。同一细菌对不同药物的敏感性用MIC值衡量，值越小，说明越敏感，其抗菌药物的作用越强。检测结果显示：七种傣药解药不同极性萃取物均可检测最小抑菌浓度，MLDJY-1、MLDJY-2和DY-2、BHCMD-2对大肠杆菌的最小抑菌浓度为0.195mg/mL，与阳性对照药效果一致;DY-2和MLDJY-2在0.781mg/mL浓度下显示出最绿脓假单胞菌的最小抑菌浓度。

3.3 最小杀菌浓度（MBC）的检测 最小杀菌浓度（MBC）是最初的试验活菌数减少99.9%或以上所需要的最低抗菌药物的浓度。由表5实验结果显示，七种傣药解药品种不同极性萃取物对大肠杆菌的最小杀菌浓度均优于对绿脓假单胞菌的最小杀菌浓度。MLDJY-2对大肠杆菌的MBC为3.125mg/mL，效果最好;MLDJY-1、MLDJY-2、DY-2和HCP-1对绿脓假单胞菌的MBC为6.25mg/mL;BHCMD-3、TGC-3和YGC-3均为检测出对大肠杆菌和绿脓假单胞菌的MBC。

4 讨论

大肠杆菌（Escherichia coli），又叫大肠埃希氏菌，是条件致病菌，是人和动物肠道中最主要和数量最多的一种细菌，主要寄生于大肠内。在一定条件下可以引起人和多种动物发生胃肠道感染或尿道等多种局部组织器官感染[9]。绿脓假单胞菌（Pesudomonas pyocyaneum），是一种革兰氏阴性菌、好氧、呈长棒形的细菌，广泛分布于自然界及正常人皮肤、肠道和呼吸道，由于对抗菌素有较强的抗性，已成了医院内感染的重要细菌，是临床上较常见的条件致病菌之一[10]。

本研究抑菌实验结果显示：7种傣药材不同极性提取物均显示抑菌活性，各药材乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物的抑菌活性优于水萃取物，可能由于水部位含糖量较高，有利于细菌生长，而其他部位的一类或几类次生代谢产物之间相互作用发挥抑菌活性。7种傣药材提取物中，勐腊大解药（平脉藤）乙酸乙酯萃取部位抑菌效果最好，有研究报道，勐腊大解药中的主要抑菌成分为异戊烯化苯甲酸衍生物[11]，其他成分未见报道。栘树皮和海船皮中中主要含有黄酮类成分[12-13]，野甘草中含有二萜、生物碱、黄酮、三萜等类型成分[14]，竹叶兰中含有内酯、香豆素、黄酮、多糖等成分[15]，选取的傣药材虽然临床应用历史悠久，效果显著，但其发挥抑菌作用的物质基础不明确，作用机制不清楚等问题。

本实验的研究结果为傣药材抗菌活性和作用机制的研究奠定了前期基础，为傣药产业的现代化研究提供探索途径。

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（收稿日期：2020-08-13 编辑：刘斌）