ＨＰＬＣ切换波长法测定益肾灵颗粒（无蔗糖）中特女贞苷、淫羊藿苷、补骨脂素和异补骨脂素的含量

方慧祥 崔庆德 吕晋

【摘 要】 目的：建立高效液相色谱法同时测定益肾灵颗粒（无蔗糖）中特女贞苷、淫羊藿苷、补骨脂素和异补骨脂素含量的方法。方法：色谱柱为依利特 C18柱（250mm×4.6mm，5μm），柱温为30℃;流动相为甲醇-乙腈-水，梯度洗脱;流速为1.0mL·min-1; 检测波长为224nm、270nm 、246nm。结果：特女贞苷、、淫羊藿苷补骨脂素、异补骨脂素的进样量分别在0.03401～0.8501μg（r=0.9997，n=7）、0.1006～2.5151μg （r=1.0000，n=7）、0.01916～0.4790μg（r=0.9999，n=7）、0.02020～0.5051μg （r=0.9999，n=7）范围内与其峰面积积分值呈良好的线性关系;精密度、重复性、稳定性试验的RSD均<1.0%;平均加样回收率分别为98.5%、100.6%、99.4%、98.9%，RSD分别为0.50%、0.93%、0.49%、0.65%（n=6）。结论：本方法专属性强、精密度高、分离度及重现性好，可用于测定益肾灵颗粒（无蔗糖）中特女贞苷、淫羊藿苷、补骨脂素和异补骨脂素的含量。

【关键词】 高效液相色谱法;益肾灵颗粒（无蔗糖）;特女贞苷;淫羊藿苷;补骨脂素;异补骨脂素;含量测定

Abstract：Objective To establish a method for content determination of Specnuezhenide，Psoralen，Angelicin and Icariin in Yishenling granules simultaneously. Methods The determination was performed on Yilite C18 column（250mm×4.6mm，5μm）with mobile phase consisted of methanol- acetonitrile-water at the flow rate of 1.0mL/min. The column temperature was 30℃，and the detection wavelengths were set at 224nm，246nm and 270nm. Results The method achieved good linearity in the ranges of 0.03401～0.8501μg（r=0.999 7，n=7）for Specnuezhenide，0.01916～0.4790μg（r=0.9999，n=7）for Psoralen，0.02020～0.5051μg （r=0.999 9，n=7）for Angelicin and 0.1006～2.5151μg （r=1.0000，n=7）for Icariin. The RSDs of precision，reproducibility and stability tests were lower than 1.0%. The average recoveries were 98.5%，99.4%，98.9% and 100.6%，the RSDs were 0.50%，0.49%，0.65%and 0.93%（n=6）. Conclusions The method is specific，precise and reproducible. It can be used for the content determination of Specnuezhenide，Psoralen，Angelicin and Icariin in Yishenling granules.

Keywords：HPLC;Yishenling Granules（Sucrose-free）;Specnuezhenide;Icariin;Psoralen;Angelicin;Content Determination

益肾灵颗粒为中国药典[1]收载品种，由枸杞子、女贞子、附子（制）、芡实（炒）、车前子（炒）、补骨脂（炒）、覆盆子、五味子、桑椹、沙苑子、韭菜子（炒）、淫羊藿、金樱子十三味中药材组成。益肾灵颗粒具有温阳补肾之功效，用于肾气亏虚、阳气不足所致的阳痿、早泄、遗精或弱精症。淫羊藿和补骨脂均为方中君药，女贞子为方中臣药，现代药理研究表明，女贞子有促进生长[2]、增强体质[3]、强心[4]等作用;补骨脂有抗肿瘤[5] 、抗骨质疏松[6] 、抗氧化[7] 等作用;淫羊藿有促进生殖[8]、提高免疫[9]、增加骨密度[10]、抗肿瘤[11]等作用。特女贞苷为女贞子的主要成分，具有调节免疫、抗氧化、抗衰老等作用，补骨脂素和异补骨脂素为补骨脂的主要成分，具有植物雌激素作用;淫羊藿苷为淫羊藿的主要成分，具有滋阴补阳、促进造骨细胞增殖等作用，中国药典[1]选择特女贞苷、补骨脂素和异补骨脂素、淫羊藿苷分别作为女贞子、补骨脂、淫羊藿三种药材的含量测定指标。有文献[12]报道HPLC法同时测定益肾灵颗粒中补骨脂素、异补骨脂素和淫羊藿苷的含量，但同时测定君药淫羊藿和补骨脂以及臣药女贞子中淫羊藿苷、补骨脂素、异补骨脂素和特女贞苷的含量未见报道。本实验参考中国药典[1]及相关文献[12-18]，建立HPLC切换波长法同时测定益肾灵颗粒（无蔗糖）中特女贞苷、补骨脂素、异补骨脂素和淫羊藿苷的含量方法。

1 仪器与材料

1.1 仪器 岛津LC-20AT型高效液相色谱仪（配有LC-20AT型输液泵，CBM-20A型控制器， SIL-20A型自动进样器，CTO-10AS vp型柱温箱，SPD-20A型紫外检测器，DGU-20A5型脱气机，LCsolution色谱工作站）（日本岛津制作所），XS105型电子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）。

1.2 材料 特女贞苷对照品（批号：111926-201605，含量：93.3%），补骨脂素对照品（批号：110739-201617，含量：99.7%），异补骨脂素对照品（批号：110738-201614，含量：99.9%），淫羊藿苷对照品（批号：110737-201516，含量：94.2%），均购置于中国食品药品检定研究院;乙腈为色谱纯（德国默克公司）;水为双蒸水;其余试剂均为分析纯;益肾灵颗粒（无蔗糖）（福建省泉州恒达制药有限公司，批号： 20150409、20160324、20160913）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：依利特 C18柱（250mm×4.6mm，5μm），柱温为30℃;流动相：甲醇（A） -乙腈（B）-水（C），梯度洗脱（25%A始终保持不变;0～35min，7% B→19% B，35～50min，19% B→19% B，50.01～60min，7% B→7% B）;流速为1.0 mL·min-1; 检测波长：0～20min，224nm（特女贞苷）;20～35min，246nm（补骨脂素、异补骨脂素）;35～60min，270nm（淫羊藿苷）;进样量：10 μL。

2.2 样品制备

2.2.1 对照品溶液的制备 分别精密称取特女贞苷、淫羊藿苷、补骨脂素、异补骨脂素对照品22.78mg、66.75mg 、12.01mg、12.64mg置50mL容量瓶中，加甲醇使溶解，并稀释至刻度，摇匀，得混合对照品储备液（质量浓度： 特女贞苷为0.4251mg·mL-1，淫羊藿苷为1.2576mg·mL-1，补骨脂素为0.239 5mg·mL-1，异补骨脂素为0.2525mg·mL-1），精密量取混合对照品储备液1mL，置25mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品使用液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取益肾灵颗粒（无蔗糖）5袋，精密称定，研细，取约5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60%乙醇50mL，稱定重量，置水浴上回流1 h，放冷，再称定重量，用60%乙醇补足减少的重量，摇匀，静置，取上清液用0.45μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。

2.2.3 阴性对照溶液的制备 按处方比例及工艺，分别制得缺女贞子、缺补骨脂、缺淫羊藿的阴性对照，按“2.2.2”项下方法制成阴性对照溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察 分别精密量取“2.2.1”项下的混合对照品储备液0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL， 分别置25mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，即得。分别进样10μL，记录峰面积。以进样量（x，μg）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标，进行线性回归，分别得特女贞苷、补骨脂素、异补骨脂素和淫羊藿苷回归方程为y=1268121.8x+250.4，r=0.9997（n=7）;y=7680626.9x+1180.9，r=0.9999（n=7）;y=7581018.9x+4347.4，r=0.9999（n=7）;和y=2297168.2x+1699.7，r=1.0000（n=7）。结果表明，特女贞苷、补骨脂素、异补骨脂素和淫羊藿苷的进样量分别在0.03401～0.8501μg、0.01916～0.4790μg、0.02020～0.5051μg、和0.1006～2.5151μg的范围内与其峰面积积分值呈良好的线性关系。混合对照品、供试品及阴性对照的色谱图如图1所示。

2.3.2 精密度试验 精密吸取“2.2.2”项下经0.45μm的微孔滤膜滤过的供试品溶液10μL，连续进样6次，记录峰面积。结果，特女贞苷、补骨脂素、异补骨脂素和淫羊藿苷峰面积的RSD分别为0.74%、0.56%、0.58%和0.43%。表明仪器精密度良好。

2.3.3 空白试验 吸取“2.2.3”项下的阴性对照溶液，用0.45μm的微孔滤膜滤过，精密吸取10μL，注入液相色谱仪，结果显示，阴性对照在与对照品和供试品色谱峰保留时间相应位置上，没有相应的色谱峰，表明阴性对照不干扰测定。

2.3.4 重复性试验 取同一批样品（批号：20160324）6份，按“2.2.2”项下制备，测定特女贞苷、补骨脂素、异补骨脂素和淫羊藿苷的含量，其含量的RSD分别为0.75%、0.86%、0.79%和0.60%，表明方法重复性良好。

2.3.5 稳定性试验 取“2.2.2”项下制备好的同一份样品，分别在0、2、4、8、16、24、36h进样10μL，记录峰面积。结果，特女贞苷、补骨脂素、异补骨脂素和淫羊藿苷峰面积的RSD分别为0.96%、0.69%、0.73%和0.55%，表明样品在36h内稳定。

2.3.6 加样回收率试验 取已知含量的益肾灵颗粒（无蔗糖）（批号：20160324）6份，每份约3g，精密称定，精密加入“2.2.1”项下的混合对照品储备液1mL，再精密加入60%乙醇49mL，按“2.2.2”项下操作。测得加样回收率见表1。

2.3.7 样品测定结果 分别取3批益肾灵颗粒（无蔗糖），按“2.2.2”项下的方法操作，测定含量。结果见表2。

3 讨论

3.1 提取方法的选择 参考中国药典[1]及相关文献[12-15]，以提取溶剂（甲醇和乙醇）、提取溶剂浓度（40%、60%、80%、100%）、提取方法（超声和回流）、提取时间（20min、40min、60min、80min）为试验因素进行正交试验，发现用60%的乙醇回流提取1 h效果最好。从而确定用60%的乙醇回流提取1 h为本试验的提取方法。

3.2 检测波长的选择 分别取特女贞苷、补骨脂素、异补骨脂素和淫羊藿苷对照品溶液在200～500nm范围内进行紫外扫描，特女贞苷、补骨脂素、异补骨脂素和淫羊藿苷分别在224nm、246nm、246nm和270nm处有最大吸收。为简化方法，参考中国药典[1]及文献[12-13，17-18]使用的检测波长，进行单波长同时检测以上四个成分，当用224nm波长时，补骨脂素、异补骨脂素和淫羊藿苷响应值偏低，当用246nm时，特女贞苷和淫羊藿苷响应值偏低，当用270nm时，特女贞苷、补骨脂素和异补骨脂素响应值偏低，不利于定量测定，故最终定为切换波长法进行测定。

3.3 流动相的选择 曾尝试用甲醇-水系统或乙腈-水系统进行分离，当采用甲醇-水系统时异补骨脂素的保留时间与淫羊藿苷的保留时间相差太远，浪费分析时间，当采用乙腈-水系统时异补骨脂素的保留时间与淫羊藿苷的保留时间相差太近，不利于切换波长，最后采用甲醇-乙腈-水系统得到良好效果，因此本试实验最终将流动相甲醇-乙腈-水进行梯度洗脱。

现代医学研究[19-20]发现，益肾灵颗粒对改善少、弱精男性的精液质量有较好的临床疗效。益肾灵颗粒中淫羊藿为补肾壮阳之要药，具有补肾阳的功效，补骨脂具有温肾助阳的功效，女贞子具有滋补肝肾的功效。中成药的临床疗效是来自组方中各味中药的综合作用，为保证临床疗效，同时控制多味中药质量显得尤为重要。本方法能同时测定益肾灵颗粒（无蔗糖）中特女贞苷、补骨脂素、异补骨脂素和淫羊藿苷的含量，对保证益肾灵颗粒临床疗效发挥积极作用。

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