基于GC-MS和感官评价筛选蛋腐乳的最适菌种

李瑞英，吉艳莉，王泽琳，仝其根

（1 北京农学院食品科学与工程学院 北京102206 2 食品质量与安全北京实验室 北京100022 3 蛋品安全生产与加工北京市工程研究中心 北京100094）

鸡蛋富含多种营养物质[1]。现有的深加工蛋制品包括再制蛋类、干蛋类和冰蛋[2]。再制蛋类包括皮蛋[3-4]、糟蛋[5-7]等，干蛋类包括蛋黄粉[8-9]、全蛋粉[9]等。此外，还有发酵类蛋制品，比如发酵蛋乳饮料[10]、发酵蛋乳酸奶[11]、豆浆鸡蛋发酵饮品[12]、臭蛋制品[13]等。李双峰[14]发明了一种鸡蛋发酵食品及其制备方法。沙菲等[15]研发了一种新型发酵蛋制品，将鸡蛋制成鸡蛋干后经霉菌发酵，再进行腌制和后酵，制成鸡蛋腐乳。国内蛋类产品的研究较多，然而在发酵制品方面的研究相对较少，并且风味不被大众接受。本试验通过单一菌种和复配菌种分别发酵的方式，并结合不同菌种蛋腐乳质构情况筛选出使蛋腐乳风味和质构都好的发酵菌种。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

德清源A＋鲜鸡蛋，北京德清源农业科技股份有限公司；亚硫酸氢钠，北京世纪红星化工有限责任公司；五通桥毛霉（W4）、米根霉（M4）、藤黄微球菌（M.luteus），鲁氏酵母菌（S 酵母）均保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心；后酵汤汁（主要成分为红曲米膏、黄酒、面曲），北京市昌平区永旺超市。

MT50 嵌入式蒸汽烤箱，佛山市雷哲电器有限公司；HDGDSJ-500 型恒温恒湿试验箱，上海衡鼎仪器设备厂；57328-U 顶空固相微萃取头（Gray，50/30 μm DVB/CAR/PDMS），美国Supelco 公司；7890A-5975C 气相色谱-质谱联用仪，美国Agilent 公司；CT3 质构分析仪，美国Brookfield 公司。

1.2 试验方法

1.2.1 蛋腐乳的制作 用搅拌机将全蛋液均匀打散，将蛋液用不锈钢超细过滤网漏勺过滤以滤去卵黄系带。加入0.05%的亚硫酸氢钠保持蛋液的颜色，搅拌均匀，45℃水浴30 min 后在45℃条件下用旋转蒸发仪旋蒸10 min，滤除气泡。85℃蒸汽烤箱蒸40 min，晾凉后高压蒸汽灭菌（105℃，15 min）制成蛋坯备用。将蛋坯切成2.5 cm×2.5 cm×1.6 cm 的小块，将试验菌制成菌液，蛋坯表面均匀喷洒菌液，28℃前酵40 h 后搓毛，搓毛后装瓶（每瓶装4 小块），灌入100 mL 后酵汤汁，于25℃条件下在密封瓶中后酵。

1.2.2 红方汤汁的制作将4.5 g 红曲和2.8 g 面曲用粉碎机研磨成粉状。将一定量的黄酒与红曲、面曲混合均匀，酒精度控制在15～16%vol，再加入8%的食盐。将混合均匀的汤汁用高压锅煮制微沸状态，保持15 min，自然条件下晾凉，即为红方汤汁。

1.2.3 感官评价选取10 位感官评价员进行感官评定，参考SB/T 10170-2007《腐乳》中的腐乳感官要求，并结合鸡蛋腐乳的特性，分别从色泽、块型、香气、滋味、口感5 个方面进行评分。评定的最终得分以平均值计算，具体评分标准见表1。

表1 鸡蛋腐乳感官评价表Table 1 Sensory evaluation table of egg fermented bean curd

1.2.4 GC-MS 检测

1.2.4.1 顶空固相微萃取条件[16]准确称量5.0 g样品，放置于15 mL 的螺口样品瓶中，将螺口样品瓶密封，放在80℃的恒温水浴锅中水浴平衡10 min。将SPME 萃取头插入瓶中，使之处于样品上方一定距离处，避免萃取头接触到样品。推出纤维头在选定的温度条件下顶空吸附40 min，然后将萃取头插入气相色谱质谱联用仪，在250℃温度条件下解吸5 min。

1.2.4.2 色谱-质谱条件[16]色谱条件：色谱柱HP-5MS（0.25 mm×30 m，0.25 μm）弹性石英毛细管柱；升温程序的起始柱温50℃，保持2 min，以4℃/min 上升至160℃，不保留，以6℃/min 上升至270℃，保持12 min；载气为He 气，载气流量1.2 mL/min；恒压40 kPa，不分流；进样口温度与接口温度均为250℃，检测温度200℃。

质谱条件：电子轰击为EI 离子源；离子源温度200℃；电子能量70 eV；质量扫描范围（m/z）50～500 u。

1.2.4.3 试验数据分析[16]试验数据由计算机谱库NIST、Wiley 进行检索与分析，确定鸡蛋腐乳中各个挥发性物质。半定量分析：采用峰面积归一化法计算样品中各个组分的相对百分含量。

式中，M——单组份风味成分的峰面积；N——总峰面积。

1.2.5 理化指标测定

1）总酸含量 采用SB/T 10170-2007《腐乳》中总酸的检测方法。使用氢氧化钠标准溶液滴定，以酸度计测定终点，结果以乳酸表示[17]。

2）氨基酸态氮含量 采用SB/T 10170-2007《腐乳》的氨基酸态氮含量的检测方法。依据氨基酸的两性作用的原理，加入甲醛固定氨基的碱性，使羧基显示出酸性，用氢氧化钠标准溶液滴定，以酸度计测定终点[17]。

1.2.6 质构测定[18]选取块型整齐、均匀的鸡蛋腐乳，除去汤汁和蛋腐乳的外表皮，从中心部位切取1.5 cm×1.5 cm×1.5 cm 的样品，放置于质构仪操作台的中央部位，采用二次下压法测定鸡蛋腐乳的质构曲线。测定前速度0.5 mm/s，测试速度1.0 mm/s，两次下压停留间隔时间5 s，形变50%，每组样品测定5 次，去除1 个最低值和1 个最高值，取剩余值的平均值。

1.2.7 氨基甲酸乙酯（EC）含量测定 根据赵依芃等[19]的方法检测腐乳中EC 的含量。

1.2.8 验证试验 根据GC-MS、感官评价、总酸含量、氨基酸肽氮含量、质构和EC 含量的测定结果，筛选出最适合蛋腐乳发酵的菌种，再用该菌种发酵的蛋腐乳根据1.2.4 节的检测方法进行GCMS 的验证试验。

2 结果与讨论

2.1 发酵菌组合对蛋腐乳风味的影响

分别用五通桥毛霉、五通桥毛霉+鲁氏酵母菌复配、藤黄微球菌、藤黄微球菌+鲁氏酵母菌复配、米根霉、米根霉+鲁氏酵母菌复配6 组前酵菌种发酵40 h 后进行后酵。分别在后酵3，23，38，53，63，73，100 d 进行感官评价和GC-MS 测定。

2.1.1 不同发酵时间GC-MS 分析根据6 组前酵菌种发酵蛋腐乳中风味物质的GC-MS 分析结果，以五通桥毛霉、五通桥毛霉+鲁氏酵母菌复配作为前酵菌种的蛋腐乳，在后酵不同阶段共检出93 种挥发性物质，其中烃类20 种、醛类13 种、醇类6 种、酸类12 种、酯类28 种、酮酚类7 种、其它类7 种。

由图1～2 可知，不同后酵阶段的各类挥发性成分含量有明显变化。以五通桥毛霉作为前酵菌种发酵的蛋腐乳具有烃类物质减少，脂类和醇类物质增加的特点，并且其酯类和醇类化合物占总挥发性风味物质的比例较高，是主要挥发性成分；以五通桥毛霉+鲁氏酵母菌复配作为前酵菌种发酵的蛋腐乳的主要挥发性成分除酯类和醇类化合物外，酸类物质也占了一定的比例。

图1 五通桥毛霉发酵蛋腐乳不同阶段挥发性风味成分的相对百分含量Fig.1 Relative percentage of volatile flavor components in different stages of Mucor wutongqiao egg fermented bean curd

结合表2感官评价结果可以看出，五通桥毛霉蛋腐乳风味变化较为平缓，在后酵23 d 时，感官评价分数最高。在后酵23 d 的五通桥毛霉蛋腐乳中，相对含量由高到低依次为醇类（59.09%）、酯类（28.31%）、醛类（5.16%）、其它类（5%）及酮酚类（1.13%），烃类（0.24%）和酸类（0.14%）所占比例较少。五通桥毛霉+鲁氏酵母菌复配蛋腐乳的感官评价总分比五通桥毛霉蛋腐乳稍低，香气评分也远远低于五通桥毛霉蛋腐乳，然而滋味评分跟五通桥毛霉蛋腐乳相差不多。后酵73 d，五通桥毛霉+鲁氏酵母菌复配的蛋腐乳感官评价总分最高，其相对含量由高到低依次为酯类（92.75%）、醇类（3.09%）、酸类（1.33%）及醛类（1.33%），酮酚类（0.15%）、其它类（0.14%）和烃类（0.06%）占比较少。

图2 五通桥毛霉+鲁氏酵母菌复配发酵蛋腐乳不同阶段挥发性风味成分的相对百分含量Fig.2 Relative percentage of volatile flavor components in different stages of Mucor wutongqiao and Saccharomyces rouxii mixed egg fermented bean curd

发酵菌种是藤黄微球菌、藤黄微球菌+鲁氏酵母菌复配的蛋腐乳，在后酵不同阶段共检出88 种挥发性物质，其中烃类19 种、醛类12 种、醇类7种、酸类13 种、酯类25 种、酮酚类8 种、其它类4 种。

由图3可知，与五通桥毛霉蛋腐乳、五通桥毛霉+鲁氏酵母菌复配蛋腐乳相比，藤黄微球菌发酵的蛋腐乳在后酵不同阶段醇类物质相对含量有明显增加，酯类物质有所减少。结合表2感官评价结果可以看出，藤黄微球菌发酵的蛋腐乳、藤黄微球菌+鲁氏酵母菌复配的蛋腐乳在后酵100 d 过程中感官评分变化很大。从香气评分来看，藤黄微球菌+鲁氏酵母菌复配发酵的蛋腐乳香气评分越来越高，而藤黄微球菌发酵的蛋腐乳却有逐渐降低的趋势。后酵53 d，藤黄微球菌发酵的蛋腐乳综合评分最高，相对含量由高到低依次为醇类（57.22%）、酯类（34.9%）、酸类（2.9%）、醛类（1.88%）、酮酚类（1.24%）、其它类（1.22%）和烃类（0.45%）；后酵23 d，藤黄微球菌+鲁氏酵母菌复配蛋腐乳的综合评分和香气评分最高，其挥发性物质的相对含量由高到低依次为酯类（43.16%）、醇类（39.16%）、酸类（15.06%）、醛类（1.53%）、其它类（1.02%）和烃类（0.07%）。

图3 藤黄微球菌发酵蛋腐乳不同阶段挥发性风味成分的相对含量Fig.3 Relative percentage of volatile flavor components in different stages of Micrococcus luteus egg fermented bean curd

图4 藤黄微球菌+鲁氏酵母菌复配发酵蛋腐乳不同阶段挥发性风味成分的相对含量Fig.4 Relative percentage of volatile flavor components in different stages of Micrococcus luteus and Saccharomyces rouxii mixed egg fermented bean curd

用米根霉、米根霉+鲁氏酵母菌复配作为前酵菌种的蛋腐乳，在后酵不同阶段共检出56 种挥发性物质，其中烃类5 种、醛类6 种、醇类2 种、酸类7 种、酯类28 种、酮酚类6 种、其它类2 种。与之前4 种腐乳相比，米根霉、米根霉+鲁氏酵母菌复配的腐乳中挥发性风味物质的种类大大减少，结合图5～6 发现，酯类物质占比最高达90%以上。总体来说，米根霉发酵的蛋腐乳香气评分比米根霉+鲁氏酵母菌复配的蛋腐乳要高，但两者的滋味评分都不高，这是由于2 种蛋腐乳都发涩所致。

图5 米根霉发酵蛋腐乳不同阶段挥发性风味成分的相对含量Fig.5 Relative percentage of volatile flavor components in different stages of Rhizopus oryzae egg fermented bean curd

2.1.2 不同发酵时间的样品风味感观评价分析 由表2感官评价表可知，不同发酵菌种相同发酵阶段下五通桥毛霉蛋腐乳的评分最高，风味最好，其次是五通桥毛霉+鲁氏酵母菌复配蛋腐乳。同一发酵菌种，五通桥毛霉蛋腐乳发酵100 d 时评分最高；五通桥毛霉+鲁氏酵母菌复配蛋腐乳发酵73 d 时评分最高；藤黄微球菌蛋腐乳发酵53 d 时评分最高；藤黄微球菌+鲁氏酵母菌复配蛋腐乳发酵23 d 时评分最高；米根霉蛋腐乳发酵73 d 时评分最高；米根霉+鲁氏酵母菌复配蛋腐乳发酵38 d 时评分最高。五通桥毛霉蛋腐乳与藤黄微球菌蛋腐乳、藤黄微球菌+鲁氏酵母菌复配蛋腐乳、米根霉蛋腐乳、米根霉+鲁氏酵母菌复配蛋腐乳的感官评分都具有显著性差异。藤黄微球菌蛋腐乳是感官评分最差的蛋腐乳，可能是由于在蛋腐乳发酵过程中产生了2-甲基丁酸和癸酸这2 种与腐臭味相关的化合物，而五通桥毛霉蛋腐乳、米根霉蛋腐乳和米根霉+鲁氏酵母菌复配蛋腐乳没有产生这2 种物质。五通桥毛霉+鲁氏酵母菌复配蛋腐乳只在发酵第3 天产生癸酸且含量非常低（仅0.04%），故对风味没有产生太大影响。米根霉蛋腐乳和米根霉+鲁氏酵母菌复配蛋腐乳产生的挥发性风味物质中酯类物质太多（酯类挥发性风味物质占90%以上，醇类挥发性风味物质中愉悦风味物质只产生了苯乙醇、对羟基苯乙醇2 种，且它们的含量极低），2 种蛋腐乳产生的挥发性风味物质的种类较少，而且感官评价过程中米根霉蛋腐乳和米根霉+鲁氏酵母菌复配蛋腐乳会发涩，这是2 种腐乳感官评价低的主要原因。

图6 米根霉+鲁氏酵母菌复配发酵蛋腐乳不同阶段挥发性风味成分的相对含量Fig.6 Relative percentage of volatile flavor components in different stages of Rhizopus oryzae and Saccharomyces rouxii mixed egg fermented bean curd

表2 不同菌种发酵不同阶段感官评价分值Table 2 Sensory evaluation scores of different strains at different stages of fermentation

2.2 腐乳后酵不同阶段的风味物质成分分析

2.2.1 烃类化合物 在蛋腐乳后酵过程中检出的烃类化合物共25 种，分别是十二烷、环十二烷、正十三烷、正十四烷、正十五烷、正十六烷、正十七烷、正十八烷、正二十烷、二十五烷、1，2-环氧十八烷、二十七烷、正二十八烷、正三十四烷、三癸基环氧乙烷、正癸烯、环十二烯、2-十四（碳）烯、1-十四烯、7-十四碳烯、1-石竹烯、十五烯、十七烯、1-十九烯和氧化石竹烯。不同前酵菌种蛋腐乳的烃类化合物相对含量差异较大，米根霉发酵的蛋腐乳只有5 种烃类物质，远远低于其它菌种发酵的蛋腐乳。烃类物质的阈值都非常高，因此对风味的贡献并不明显[20]。

2.2.2 醛类化合物 醛类物质阈值较低[21]，相对含量不同会使产品风味差异较大。醛类物质主要呈青草、脂肪臭，有的呈花香、水果香。蛋腐乳后酵过程中共检出15 种醛类化合物，分别是5-甲基呋喃醛、苯甲醛、苯乙醛、对甲氧基苯甲醛、壬醛、阿托醛、反，反-2，4-壬二烯醛、2-苯基巴豆醛、2，4-癸二烯醛、反式-2，4-癸二烯醛、癸醛、反式-2-癸烯醛、2-十一烯醛、4-N-戊（烷）基苯甲醛和肉豆蔻醛。苯甲醛产生苦杏仁味[21]，苯乙醛具有风信子香味。辛醛具有腊香、苹果皮香、橙柑香气，明显的脂肪和水果气味[22]。壬醛有强烈的脂肪气息，类似牛脂，稀释时具有橙子及玫瑰香气[22]。本试验中醛类相对含量较高的是五通桥毛霉蛋腐乳（18.18%）、藤黄微球菌+鲁氏酵母菌复配发酵的蛋腐乳（17.88%）和藤黄微球菌发酵的蛋腐乳（16.91%）。

2.2.3 醇类化合物 醇类物质被认为是脂肪酸氧化的产物[23]，可能是在发酵过程中，丰富的脂肪酸氧化分解为醇类物质，使其风味增加。挥发性较高的不饱和醇均有特殊香气，而其它醇类阈值很高，对食品风味的贡献较小[24]。蛋腐乳后酵过程中共检出9 种醇类化合物，分别是苯甲醇、苯乙醇、1-苯基-2-丙醇、1-甲基环己醇、对羟基苯乙醇、反式-2-癸烯醇、十二醇、色醇和十三醇。醇类物质主要呈水果香，有的有花香，但烯醇的风味与其它饱和醇并不相同，呈青草、尘土风味[25]。

2.2.4 酸类化合物 酸类化合物可能来自脂肪的氧化和微生物发酵[26]，也可能是碳水化合物分解的产物[27]。蛋腐乳后酵过程中共检出16 种酸类化合物，分别是异戊酸、2-甲基丁酸、2-甲基己酸、苯乙酸、辛酸、癸酸、肉豆蔻酸、γ-亚麻酸、棕榈酸、油酸、亚油酸、反油酸、花生四烯酸、顺-8，11，14-二十碳三烯酸、顺-6-十八碳烯酸和顺式-十八碳烯酸。在后酵过程中产生的最主要的酸类物质就是棕榈酸。2-甲基丁酸和癸酸与酸臭味有关[25]，五通桥毛霉+鲁氏酵母菌复配发酵的蛋腐乳中出现了癸酸（0.04%），而在藤黄微球菌蛋腐乳中2-甲基丁酸最高达1.02%，藤黄微球菌+鲁氏酵母菌复配蛋腐乳癸酸最高达0.44%，其它3 种蛋腐乳没有产生这2 种酸类物质。

2.2.5 酯类化合物 在蛋腐乳后酵过程中检出种类最多的化合物就是酯类物质，共检出37 种，其中棕榈酸乙酯、十四酸乙酯、油酸乙酯、辛酸乙酯和丁二酸二乙酯含量较高。酯类物质一般都能提供花香和水果香韵[28]。棕榈酸乙酯呈微弱蜡香、果香和奶油香气[29]；十四酸乙酯呈椰子和蜂蜡似风味[30]；辛酸乙酯呈果香和脂肪香；丁二酸二乙酯呈酒香和果香。有研究表明酯类物质主要是由酒中的酸类物质与醇类物质发生酯化反应生产的[31-32]。还有一部分是由鲁氏酵母菌和其它微生物在发酵过程中产生的[33]。

2.2.6 酮酚类以及其它化合物 在蛋腐乳后酵过程中共检出12 种酮酚类化合物。酮类化合物具有独特的清香和果香风味[21]。由于酚类阈值较低，故其具有相对较高的气味活度值[34]。12 种酮酚类化合物中愉悦挥发性风味物质有2-甲氧基-4-烯丙基酚（又叫丁香酚），具有丁香和果香[25]。在蛋腐乳后酵过程中还检出8 种其它类化合物，其中2-正戊基呋喃阈值较低，具有豆香和青草味[35]，只在五通桥毛霉+鲁氏酵母菌复配发酵的蛋腐乳中产生。6 组腐乳样品中都检测到了茴香脑，茴香脑带有甜味，具有茴香的特殊香气[36]。

2.3 发酵菌组合对总酸和氨基酸氮含量的影响

总酸含量是衡量蛋腐乳质量的重要指标之一，蛋腐乳的酸度主要由发酵过程中产生的有机酸、游离氨基酸、游离脂肪酸等形成。从图7和图8可以看出，各个菌种发酵的蛋腐乳中，只有五通桥毛霉发酵的蛋腐乳总酸含量降低，由发酵38 d的0.5265 g/100 g 降到发酵73 d 的0.324 g/100 g，其余菌种发酵蛋腐乳的总酸均有所增加，但变化不大。相对于总酸含量而言，氨基酸态氮含量的变化很大，氨基酸态氮含量越高，氨基酸含量越高，蛋腐乳的鲜味越好[17，20]。与发酵38 d 相比，发酵73 d 时各个菌种发酵蛋腐乳的氨基酸态氮均有不同程度的增加，其中五通桥毛霉蛋腐乳的氨基酸态氮含量最高为1.002 g/100 g，说明五通桥毛霉蛋腐乳中氨基酸含量最高，五通桥毛霉+鲁氏酵母菌复配蛋腐乳的氨基酸态氮含量次之（0.966 g/100 g），藤黄微球菌发酵蛋腐乳的氨基酸态氮含量最低（0.714 g/100 g）。蛋腐乳总酸含量均小于1.3 g/100 g，氨基酸态氮含量均大于0.42 g/100 g，符合中华人民共和国国内贸易行业标准SB/T10170-2007《腐乳》中腐乳成熟的理化要求。

图7 不同发酵菌种的总酸和氨基酸态氮含量（发酵38 d）Fig.7 Total acid and amino acid nitrogen contents of different fermentation strains（fermentation for 38 d）

图8 不同发酵菌种总酸和氨基酸态氮含量（发酵73 d）Fig.8 Total acid and amino acid nitrogen contents of different fermentation strains（fermentation for 73 d）

由表3可以看出，这6 组菌的总酸和氨基酸态氮含量的误差较小。发酵38 d，同一菌种的总酸和氨基酸态氮含量之间具有显著性差异（P＜0.05）；酵母复配蛋腐乳和单一菌种发酵腐乳总酸含量之间和氨基态氮含量之间没有显著性差异（P＞0.05），说明鲁氏酵母菌对总酸和氨基酸态氮含量影响不大。

表3 不同发酵菌种总酸和氨基酸态氮含量Table 3 Contents of total acid and amino acid nitrogen in different fermentation strains

2.4 发酵菌组合对蛋腐乳质构的影响

根据气质数据和感官评价结果选择五通桥毛霉蛋腐乳及五通桥毛霉+鲁氏酵母菌复配蛋腐乳进行质构分析。由图9可知，发酵过程中五通桥毛霉+鲁氏酵母菌复配蛋腐乳的硬度一直低于五通桥毛霉蛋腐乳，可能是由于鲁氏酵母影响了五通桥毛霉的包被作用，使得菌丝体对豆腐坯体的包裹度下降，蛋腐乳变得松软易散，导致其硬度降低。五通桥毛霉蛋腐乳黏性的增长多于五通桥毛霉+鲁氏酵母菌复配蛋腐乳，然而五通桥毛霉蛋腐乳弹性要比五通桥毛霉+鲁氏酵母菌复配蛋腐乳降低的快且多，并且五通桥毛霉+鲁氏酵母菌复配蛋腐乳的误差比五通桥毛霉蛋腐乳大。硬度的误差较大，黏性和弹性误差较小，指标一致性较高。

图9 五通桥毛霉腐乳及五通桥毛霉+鲁氏酵母菌复配蛋腐乳发酵100 d 的硬度变化Fig.9 Hardness changes of egg fermented bean curd produced by Mucor wutongqiao，Mucor wutongqiao and Saccharomyces rouxii mixed fermentation during 100 d fermentation

图10 五通桥毛霉腐乳及五通桥毛霉+鲁氏酵母菌复配蛋腐乳发酵100 d 的黏性变化Fig.10 Viscosity changes of egg fermented bean curd produced by Mucor wutongqiao，Mucor wutongqiao and Saccharomyces rouxii mixed fermentation during 100 d fermentation

2.5 发酵菌种及发酵时间对EC 含量的影响

氨基甲酸乙酯（EC）是广泛存在于发酵食品中的一种2A 类致癌物[37]，EC 普遍存在于酒精饮料、发酵调味品、发酵乳中，尤其在黄酒、清酒、腐乳、酱油等亚洲传统食品中的含量相对较高[38-39]。

2.5.1 发酵菌种对EC 含量的影响由图12可以看出，发酵菌种不同，蛋腐乳中EC 含量差异很大。在发酵63 d 时，米根霉发酵蛋腐乳的EC含量最低（61.3 ng/g），五通桥毛霉+鲁氏酵母菌复配发酵蛋腐乳的EC 含量最高（111.6 ng/g）。有鲁氏酵母菌参与发酵的蛋腐乳EC 含量普遍高于单一菌种发酵的蛋腐乳。

2.5.2 发酵时间对EC 含量的影响从图13可以看出，在发酵100 d 过程中EC 含量逐渐升高，在100 d 时达到了95.8 ng/g。联合国粮农组织规定氨基甲酸乙酯含量不得超过20 μg/L[40]。加拿大、美国、捷克等国家分别对葡萄酒中氨基甲酸乙酯标准做出的限定，分别为30，15，30 μg/L[41]。以酒类EC 国际安全限量为参照[42]，五通桥毛霉蛋腐乳仍然是十分安全的。

图11 五通桥毛霉腐乳及五通桥毛霉+鲁氏酵母菌复配蛋腐乳发酵100 d 的弹性变化Fig.11 Elastic changes of egg fermented bean curd produced by Mucor wutongqiao，Mucor wutongqiao and Saccharomyces rouxii mixed fermentation during 100 d fermentation

图12 不同菌种发酵蛋腐乳在发酵63 d 时EC 含量Fig.12 EC contents of egg fermented bean curd fermented by different strains on 63 d fermentation

图13 不同发酵时间的五通桥毛霉蛋腐乳EC 含量的变化Fig.13 Changes of EC contents in egg fermented bean curd produced by Mucor wutongqiao at different fermentation times

2.6 验证试验结果分析

根据1.2.4 节的方法对五通桥毛霉蛋腐乳发酵100 d 的样品进行GC-MS 检测，与之前五通桥毛霉发酵100 d 样品的GC-MS 结果进行对比，分析两者之间挥发性风味成分的差别。

与五通桥毛霉蛋腐乳发酵100 d 的挥发性风味物质相比，验证试验100 d 时，烃类物质的种类和含量都有所降低，酯类物质的种类和含量相差不大，都产生了棕榈酸乙酯、丁二酸二乙酯、辛酸乙酯、十四酸乙酯这些风味较好的酯类。验证试验100 d 样品的感官评分为82.67 ±3.21，结合表2感官评价分析，A 与B 没有显著性差异且感官评价分值一致，仍然是所有蛋腐乳里分数最高的。

表4 五通桥毛霉蛋腐乳发酵100 d 样品的挥发性风味物质百分含量对比Table 4 Comparison of percentage of volatile flavor compounds in egg fermented bean curd produced by Mucor wutongqiao after 100 d fermentation

（续表4）

3 结论

利用GC-MS 技术鉴定出不同发酵菌种和发酵不同阶段的蛋腐乳样品中挥发性风味物质种类主要包括烃类、醛类、醇类、酸类、酯类、酮酚类和其它类化合物。其中苯甲醛、苯乙醛、辛醛、壬醛、苯乙醇、棕榈酸乙酯、十四酸乙酯、辛酸乙酯、丁二酸二乙酯和丁香酚是主要特征挥发性物质。在蛋腐乳后酵过程中产生不愉悦风味的物质是苯甲醛、2-甲基丁酸和癸酸。通过GC-MS 分析和感官评价可以发现五通桥毛霉发酵蛋腐乳风味最好，其次是五通桥毛霉+鲁氏酵母菌复配发酵蛋腐乳。对这6 种蛋腐乳进行总酸和氨基酸态氮含量的测定，发现五通桥毛霉蛋腐乳的氨基酸态氮含量明显高于其它蛋腐乳，品质最好。根据质构测定结果，五通桥毛霉蛋腐乳及五通桥毛霉+鲁氏酵母菌复配蛋腐乳之间的硬度、黏性和弹性相差不大。根据氨基甲酸乙酯含量的测定结果，五通桥毛霉蛋腐乳发酵100 d 过程中EC 含量逐渐升高，在100 d 时达到了95.8 ng/g，仍低于酒类EC 国际安全限量。综合来看，选择五通桥毛霉作为蛋腐乳前期发酵的菌种。