外源脱落酸处理对葡萄果实及葡萄酒中抗氧化成分的影响

朱 磊，刘云清，赵龙源，胡禧熙，臧延青，汤华成

(1.黑龙江八一农垦大学 食品学院， 黑龙江 大庆 163319；2.黑龙江省农业科学院大庆分院， 黑龙江 大庆 163316)

酚类化合物是葡萄中主要的次生代谢产物，葡萄酒中的酚类化合物绝大部分来源于葡萄果实，是在葡萄酒浸渍和发酵过程中浸提出来的。葡萄果实中的酚类化合物种类繁多，包括酚酸、芪类化合物、花色苷、黄酮醇和黄烷-3-醇等[1]，其中具有C6-C3-C6结构骨架的花色苷、黄酮醇和黄烷-3-醇属于类黄酮化合物。酚类化合物的含量和组成对葡萄果实和葡萄酒的感官和品质具有至关重要的影响：花色苷直接决定着葡萄和葡萄酒的颜色；黄烷-3-醇、黄酮醇和酚酸在葡萄酒中可作为辅色素与花色苷发生反应生成更稳定的衍生色素，使葡萄酒的颜色更加稳定；黄烷-3-醇聚合体(即单宁)决定着葡萄酒的涩度和结构特点[2-3]；黄酮醇主要影响葡萄酒的苦味[4]。

葡萄和葡萄酒中酚类化合物的含量和组成受很多因素影响，如果实基因型、气候、栽培措施和酿造工艺等。应用诱导剂和植物激素也可以有效促进酚类化合物的合成和积累。脱落酸是一种植物内源激素，现已证实葡萄中的内源脱落酸是调控果实成熟的重要植物激素[5]，同时也是葡萄抵御逆境如干旱、寒冷和微生物胁迫等的信号物质[6]。近年来，由于脱落酸的价格大幅下降，很多研究人员又重新考虑其在葡萄栽培中的潜在应用价值。研究表明，在葡萄始熟期应用外源脱落酸可以促进果实着色[7]和花色苷的积累[8]。始熟期是葡萄果实发育过程中的一个重要时期，一般需要7 d以上的时间，在这段时间内，果实开始变软，糖度增加，酸度降低，有色葡萄完成转色；葡萄的栽培管理方式也从始熟期开始改变，以期获得高品质的成熟果实。目前已有的研究只是在始熟期应用外源脱落酸，而更加精准的时期控制仍然缺乏系统研究。本研究拟在始熟期的不同阶段对欧亚种“美乐”和“赤霞珠”的果实喷施外源脱落酸，希望通过系统分析外源脱落酸对葡萄果实和葡萄酒的酚类含量、组成和抗氧化活性的影响，为确定欧亚种酿酒葡萄较佳的外源脱落酸处理阶段提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

欧亚种“美乐”和“赤霞珠”的葡萄果实源自天津蓟州区(117.39° E，24.30° N)，于2010年10月达到成熟时采摘。葡萄园的株行距分别为1.0 m和2.5 m，葡萄园采取一致的栽培管理措施，“美乐”树龄8年，“赤霞珠”树龄10年，二者皆为自根苗。

葡萄酒酵母BM45，法国Lallemand公司；脱落酸、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,4,6-三(2-吡啶基)三嗪(TPTZ)、6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸(Trolox)和标准品二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷，纯度≥99%，美国Sigma公司；色谱纯试剂乙酸、丙酮，美国Fairlawn公司。福林酚(分析纯)，天津市天大化学试剂厂。

1.2 仪器与设备

SL-N型系列电子天平，上海民桥精密仪器有限公司；LGJ-12型冻干机，北京松源华兴科技发展有限公司；FW-135型不锈钢粉碎机，天津泰斯特有限公司；SHZ-88A型水浴振荡器，江苏太仓市实验设备厂；D-375200型离心机，美国Beckman Coulter公司；RE-52A型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；UV-2800型分光光度计，上海尤尼柯仪器有限公司；PXSJ-216型离子计，上海雷磁仪器厂；WS108型手持式折光仪，北京万成北增精密仪器有限公司；1100型HPLC/MSD Trap-VL液相色谱离子阱质谱联用仪，美国Agilent公司；Kromasil-C18型(250 mm×4.6 mm, 5 μm)色谱柱，瑞典Akzo Nobel公司。

1.3 实验方法

1.3.1果实的处理

外源脱落酸的处理包括3个阶段：始熟期初期(果穗中有0～5%的果粒着色)、始熟期中期(果穗中有30%～50%的果粒着色)和始熟期末期(果穗中有95%～100%的果粒着色)。每个品种分为3个处理组和1个对照组，3个处理组分别为：在始熟期的不同阶段向果穗喷施200 mg/L的脱落酸，对照组不喷施脱落酸，每组有3个平行样。外源脱落酸喷施和果实预处理参考实验室已建立的方法[9]。

1.3.2葡萄酒的酿造方法

葡萄果实用于实验室小批量酿酒，酿造工艺参考实验室前期确立的方法[10]，每个处理具有2个葡萄酒平行样品。

1.3.3基本果实品质的测定

从每个平行样品中随机选取50粒果实，称量并记录每个果实的果粒质量，压碎果实使果汁充分流出。分别利用手持式折光仪和pH计测定果汁的可溶性固形物含量和pH值，利用滴定法测定可滴定酸含量[11]。

1.3.4酚类化合物的提取

葡萄总酚和花色苷的提取方法采用Xu等[12]的方法并略加改进。称取0.5 g原料粉末置于100 mL三角瓶中，加入20 mL提取液，混合均匀后放入水浴振荡器中，以300 r/min转速室温避光提取2 h，离心分离上清液，残渣重复提取2次，合并3次提取的上清液[11]。葡萄皮酚类提取液除1 mL用于测定酚类含量和抗氧化活性外，其余旋蒸至干，再重新溶解并定容至5 mL，用于花色苷化合物的定性和定量分析。

1.3.5酚类化合物总含量的测定

1)总酚含量采用福林酚法[13]测定。在碱性条件下，酚类物质可以把福林酚试剂中的磷钨酸和钼酸还原，生成蓝色络合物，在一定范围内，其吸光度与总酚含量呈线性关系。没食子酸为标准品，总酚的质量分数以单位质量样品中没食子酸的含量表示， mg/g。

2)类黄酮含量采用NaNO2-AlCl3法[14]测定。提取液中加入铝离子试剂时，使类黄酮化合物与铝盐形成稳定的络合物，在一定范围内，其吸光度与类黄酮含量呈线性关系。芦丁为标准品，类黄酮的质量分数以单位质量样品中芦丁的含量表示， mg/g。

3)黄烷-3-醇含量采用香草醛法[15]测定。在强酸溶液中黄烷-3-醇与香草醛发生缩合反应生成红色络合物，在一定范围内，其吸光度与黄烷-3-醇含量呈线性关系。儿茶素为标准品，黄烷-3-醇的质量分数以单位质量样品中儿茶素的含量表示， mg/g。

1.3.6抗氧化活性的测定

DPPH自由基清除能力参考Brand-Williams等[16]的方法测定。DPPH在有机溶剂中是一种稳定的自由基，其甲醇溶液呈深紫色，当DPPH溶液中加入自由基清除剂时，孤对电子被配对，吸收消失或减弱。Trolox为标准品，DPPH自由基清除能力值以单位质量或体积样品中Trolox的物质的量表示，μmol/g或mmol/L。

铁离子还原能力(FRAP)参考Benzie等[17]的方法测定。待测物中的抗氧化剂将Fe3+还原为Fe2+，Fe2+又与TPTZ螯合为最大吸收波长为595 nm的Fe2+-TPTZ复合体。Trolox为标准品，铁离子还原抗氧化能力值以单位质量或体积样品中Trolox的物质的量表示，μmol/g或mmol/L。

1.3.7花色苷化合物分析

花色苷的分析参考Jin等[18]的方法。二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷为标准品，花色苷质量分数以单位质量或体积样品中二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷的含量表示，单位mg/g或mg/L。

1.4 数据处理

所有数据均以平均值±标准偏差表示，采用软件SPSS 19.0对数据进行方差分析(ANOVA)。

2 结果与分析

2.1 始熟期不同阶段外源脱落酸处理对葡萄果实基本品质的影响

表1为在果实始熟期的不同阶段，脱落酸处理的葡萄果实质量、可溶性固形物、可滴定酸和pH值数据。由表1可知，对于同一葡萄品种，不同阶段组的各项品质指标与对照组相比均无显著差异(P>0.05)，说明在始熟期各阶段对葡萄果实进行外源脱落酸处理不会影响果实的基本品质。

表1 外源脱落酸处理后葡萄果实的基本品质Tab.1 Basic quality of grapes after treatments of exogenous ABA

2.2 始熟期不同阶段外源脱落酸处理对葡萄果实和葡萄酒酚类总含量和抗氧化活性的影响

2.2.1对果皮中酚类总含量和抗氧化活性的影响

不同的脱落酸处理阶段对“美乐”和“赤霞珠”果实和葡萄酒的酚类总含量和抗氧化活性影响的实验结果如表2。由表2可知，外源脱落酸处理不同程度地提高了2个品种葡萄皮的总酚、类黄酮和黄烷-3-醇的含量：“美乐”分别提高了14%～22%、37%～39%和7%～22%，“赤霞珠”分别提高了48%～79%、39%～170%和7%～172%。不同阶段的外源脱落酸处理对葡萄皮酚类含量的影响存在差异，两个品种始熟期初期组和中期组葡萄皮的总酚、类黄酮和黄烷-3-醇含量显著高于对照组(P<0.05)，始熟期末期组的酚类含量，只有“美乐”的总酚和类黄酮显著高于对照组(P<0.05)，其他与对照组无明显差异(P>0.05)。对于葡萄皮酚类化合物的抗氧化活性，本研究采用了2个指标进行评价，即DPPH自由基清除能力和铁离子还原能力，实验结果见表3。由表3可知，在始熟期的3个阶段利用脱落酸处理葡萄果实均能显著提高“美乐”葡萄皮酚类提取物的抗氧化活性(P<0.05)，DPPH值和FRAP值分别比对照组增加了126%～178%和98%～139%，而3个阶段的“美乐”脱落酸处理组间的抗氧化活性无显著差异(P>0.05)；“赤霞珠”始熟期初期组和中期组的葡萄皮提取物抗氧化活性与对照组相比显著提高(P<0.05)，而末期组效果不明显(P>0.05)，DPPH值和FRAP值分别比对照组提高了38%～121%和30%～97%。

表2 不同时期的外源脱落酸处理对葡萄和葡萄酒的酚类总含量的影响Tab.2 Effects of different treatment time of exogenous ABA on total phenolic contents in grapes and wines (皮、籽：mg/g, 酒：mg/L)

表3 不同时期的外源脱落酸处理对葡萄和葡萄酒抗氧化活性的影响Tab.3 Effects of different treatment time of exogenous ABA on antioxidant activities in grapes and wines (皮、籽：μmol/g, 酒：mmol/L)

2.2.2对葡萄籽中酚类总含量和抗氧化活性的影响

始熟期利用外源脱落酸处理果实对葡萄籽酚类的总含量和抗氧化活性没有显著影响(P>0.05)，而对于各项指标，不同的脱落酸处理阶段组之间亦不存在明显差异(P>0.05)，只有“赤霞珠”葡萄籽的总酚含量在4个实验组之间存在统计学上的差异(P<0.05)。

2.2.3对葡萄酒中酚类总含量和抗氧化活性的影响

由于葡萄酒中黄烷-3-醇含量较低，本研究利用香草醛法未能直接检出葡萄酒样品的黄烷-3-醇含量。由表2和表3可知，2个品种葡萄酒的总酚含量、类黄酮含量、DPPH自由基清除能力和铁离子还原能力也得到了不同程度的提高。“美乐”的4个指标分别增加了3%～25%、4%～69%、4%～46%和3%～41%，“赤霞珠”的4个指标分别增加了2%～35%、28%～32%、7%～36%和6%～32%。始熟期不同阶段的脱落酸处理对葡萄酒的影响与葡萄皮相似，始熟期初期和中期向果实喷施外源脱落酸能够显著提高酒中酚类的含量和抗氧化活性(P<0.05)；始熟期末期使用脱落酸处理的效果不明显，除了“赤霞珠”末期组葡萄酒中类黄酮含量显著高于对照组(P<0.05)外，其他指标的末期组与对照组均无显著差异(P>0.05)。

2.3 始熟期不同阶段外源脱落酸处理对葡萄果实和葡萄酒花色苷含量和组成的影响

2.3.1对果皮中花色苷含量和组成的影响

始熟期不同阶段，采用脱落酸处理后的葡萄花色苷含量和组成比例测定结果如表4和表5。 由表4可知，“美乐”和“赤霞珠”果皮花色苷的积累量分别增加了1%～143%和53%～94%。“美乐”只有始熟期中期组葡萄皮花色苷总含量显著高于对照组(P<0.05)，而始熟期初期组和末期组虽然数量上比对照组高，但不存在显著差异(P>0.05)；“赤霞珠”的3个脱落酸处理组葡萄皮花色苷的总含量都显著高于对照组(P<0.05)。在4个实验组中，两个品种始熟期中期的葡萄皮花色苷总含量最高，“美乐”为8.32 mg/g，“赤霞珠”为8.58 mg/g。

欧亚种葡萄皮花色苷主要由5种花色素的单糖苷组成，他们是花翠素、花青素、3’-甲基花翠素、甲基花青素和二甲花翠素。由表5可知，对于本研究中的两个欧亚种品种“美乐”和“赤霞珠”，二甲花翠素糖苷占总花色苷含量的比例最高(68%～81%)，其次是甲基花翠素糖苷(7%～19%)，再次是3’-甲基花翠素糖苷(5%～6%)，花翠素糖苷(3%～6%)和花青素糖苷(2%～3%)的比例最低。5种花色素单糖苷的比例在脱落酸处理组和对照组之间并没有明显而一致的变化，只有“美乐”脱落酸处理组的3’-甲基花翠素糖苷比例与对照组相比明显降低(P<0.05)。

表4 不同时期的外源脱落酸处理对葡萄皮花色苷含量的影响Tab.4 Effects of different treatment time of exogenous ABA on anthocyanin contents in grape skins mg/g

表5 不同时期的外源脱落酸处理对葡萄皮花色苷组成的影响Tab.5 Effects of different treatment time of exogenous ABA on anthocyanin compositions in grape skins mg/g

根据5种花色素分子B环取代基的不同，本研究中检测到的花色苷可分为3′,4′-取代花色苷(花青素和甲基花翠素糖苷) 和3′,4′,5′-取代花色苷(花翠素、3’-甲基花翠素和二甲花翠素糖苷)。两个实验品种中，3′,4′,5′-取代花色苷占总含量的85%～91%，为主要类型，这是由于检测到的绝大多数花色苷化合物属于二甲花翠素糖苷。如果花色苷分子B环上的羟基被甲氧基取代，可称为甲基化花色苷(3’-甲基花翠素、甲基花翠素和二甲花翠素糖苷)，两个品种的甲基化花色苷占总质量分数的91%～95%。始熟期的外源脱落酸处理对两个品种的这两种花色苷组成没有明显而一致的影响。

花色苷分子3-位葡萄糖上的6-位羟基也可以被酰基取代，称为酰基化花色苷。在本研究的两个品种中，检测到的酰基化类型包括乙酰化和香豆酰化，“美乐”以香豆酰化为主(18%～24%)，“赤霞珠”以乙酰化为主(14%～20%)。外源脱落酸处理后，两个品种成熟果实中酰基化花色苷表现出不同的变化趋势：与对照组相比，“美乐”的脱落酸处理组乙酰化花色苷升高，香豆酰化花色苷降低；“赤霞珠”则相反，即脱落酸处理组乙酰化花色苷略有降低，香豆酰化花色苷略有升高；但是其中只有“美乐”的乙酰化花色苷表现出了统计学的显著差异(P<0.05)，所以还不足以说明外源脱落酸对两个品种酰基化花色苷的组成具有显著影响。

2.3.2对葡萄酒中花色苷含量和组成的影响

不同时期采用脱落酸处理后的葡萄酒花色苷的含量和组成比例测定结果如表6和表7。由表6可知，与葡萄果实花色苷的测定结果相似，在始熟期利用外源脱落酸处理葡萄果实，可以显著提高葡萄酒总花色苷的含量。“美乐”和“赤霞珠”葡萄酒花色苷的质量浓度分别增加了12%～36%和7%～19%。除“美乐”始熟期末期组外，两个品种脱落酸处理组葡萄酒的花色苷总含量明显高于对照组(P<0.05)，其中花色苷总含量最高的是始熟期中期组，“美乐”葡萄酒为25.26 mg/L，“赤霞珠”葡萄酒为29.11 mg/L，其次是始熟期初期组，但两个阶段处理组的结果并不存在显著差异(P>0.05)。

由表7可知，由于葡萄酒中花色苷的浓度远远小于葡萄皮提取物，在葡萄酒中只检测到了甲基花青素糖苷和二甲花翠素糖苷，这两种花色素糖苷既分别属于3′,4′-取代和3′,4′,5′-取代花色苷，又都属于甲基化花色苷。“赤霞珠”脱落酸处理组葡萄酒的甲基花青素糖苷(即3′,4′-取代)的比例与对照组葡萄酒相比有降低趋势。对于葡萄酒中酰基化花色苷，“赤霞珠”脱落酸处理组葡萄酒的香豆酰花色苷比例与对照组相比明显降低(P<0.05)。

表6 不同时期的外源脱落酸处理对葡萄酒花色苷含量的影响Tab.6 Effects of different treatment time of exogenous ABA on anthocyanin contents in wines mg/L

红葡萄酒的花色苷主要来源于葡萄皮，是在葡萄破碎和酒精发酵时通过浸渍和萃取作用获得的。在葡萄酒的酿造过程中，来源于葡萄皮的花色苷分子容易与乙醛酸、丙酮酸和黄烷醇等物质发生反应生成衍生色素，没有发生这种反应的花色苷称为花色素- 葡萄糖苷或非衍生色素，衍生色素的分子结构更加稳定，对陈年葡萄酒的颜色稳定性起着至关重要的作用[13]。本研究的葡萄酒样品都是经过酒精发酵后陈酿6个月的新酒，衍生色素占总花色苷的比例已达50%～65%。在“美乐”和“赤霞珠”酒样中，检测到了3种类型的衍生色素，即吡喃型花色苷、羟苯基吡喃型花色苷和花色苷黄烷醇二聚体，其中吡喃型花色苷占总花色苷含量的比例最高(33%～43%)，其次是羟苯基吡喃型花色苷(15%～24%)，花色苷黄烷醇二聚体占比最低(0%～9%)。外源脱落酸处理对葡萄酒的衍生花色素组成的影响并不明显，只有“赤霞珠”脱落酸处理组的羟苯基吡喃型花色苷比例显著降低(P<0.05)。

表7 不同时期的外源脱落酸处理对葡萄酒花色苷组成的影响Tab.7 Effects of different treatment times of exogenous ABA on anthocyanin compositions in wines mg/L

3 讨 论

3.1 外源脱落酸对葡萄果实品质的影响

外源脱落酸处理已经被认为是一种行之有效的改进葡萄果实品质的方法。近年来的研究发现，脱落酸处理在葡萄始熟期发挥着重要作用[19-20]。已有研究表明，始熟期的外源脱落酸处理可以显著提高葡萄皮的酚类含量和抗氧化活性[21-22]。本研究表明：始熟期应用外源脱落酸处理葡萄果实，提高了“美乐”和“赤霞珠”葡萄皮的酚类总含量和抗氧化活性，其中始熟期初期和中期的效果均较显著，中期的效果最好；始熟期外源脱落酸的处理对两个品种成熟果实葡萄籽的酚类总含量和抗氧化活性没有影响。Owen等[23]对始熟期喷施外源脱落酸的“美乐”葡萄果实中的脱落酸及其代谢物进行了检测，结果发现：只有很少的外源脱落酸能进入到果实内部并进行代谢，绝大部分仍留在葡萄皮上；葡萄皮上的外源脱落酸的半衰期为1周，这使得葡萄皮的脱落酸代谢物二氢红花菜豆酸含量显著增加。这就是外源脱落酸处理对葡萄皮酚类含量影响显著却不作用于葡萄籽酚类含量的原因。

红色葡萄品种的花色苷是由始熟期开始合成和积累的，葡萄果实也由绿色转为红色。始熟期应用外源脱落酸可以增加葡萄果实的花色苷含量[22,24-27]，本研究也得到了相似的结果。出现这种情况的主要原因是花色苷合成途径中关键酶基因的表达量上调[20]，而且启动花色苷积累的基因PYL1也可由外源脱落酸上调[28]。在苯丙烷和类黄酮合成途径中的结构基因和转录因子的表达均可由外源脱落酸上调[29-31]，本研究也发现脱落酸处理组葡萄皮中每一个花色苷化合物的含量基本都比对照组高，这也解释了外源脱落酸处理对花色苷组成的影响为什么不如对花色苷总含量的影响那么显著。

始熟期外源脱落酸的处理对葡萄果实的果重、可溶性固形物、可滴定酸和pH值等基本品质没有影响，这与其他研究的结果一致[9,32]；因此，当生产目的只是要增进葡萄果实酚类含量、果实颜色和营养价值时，在始熟期进行外源脱落酸处理是非常适合的。

3.2 外源脱落酸对葡萄酒品质的影响

葡萄酒是酿酒葡萄的最终产品，本研究同时也关注外源脱落酸处理是否能够增加葡萄酒的酚类含量和抗氧化活性。研究结果正如预期，经过外源脱落酸处理的“美乐”和“赤霞珠”葡萄酒酚类总含量、花色苷总含量和抗氧化活性均得到了提高，其中始熟期初期和中期的效果明显，这说明在始熟期中期以前利用外源脱落酸处理葡萄果实可以增进葡萄酒的颜色和营养价值。Yamamoto等[33]对制汁品种“伊莎贝尔”在始熟期进行外源脱落酸处理，增加了成熟葡萄果汁的颜色和花色苷总含量，这也是脱落酸作用于葡萄皮进而对果汁产生的影响；但是外源脱落酸处理对于葡萄酒花色苷组成的影响较小，只降低了“赤霞珠”葡萄酒的香豆酰花色苷和羟苯基吡喃型花色苷的占比。酰基化花色苷可以增加花色苷分子在水溶液中的稳定性[34]，羟苯基吡喃型花色苷属于衍生色素，可提高葡萄酒的颜色稳定性[10]；然而，“赤霞珠”葡萄酒花色苷组成的细微变化是否不利于酒颜色稳定性，仍需要进一步的研究。

4 结 论

1)始熟期外源脱落酸处理对葡萄成熟果实的基本品质没有影响，包括质量、可溶性固形物、可滴定酸和pH值。

2)在始熟期中期(30%～50%果实转色)以前，外源脱落酸处理可以显著提高成熟葡萄果实和葡萄酒的酚类物质总含量和抗氧化活性，果实和酒的酚类总含量分别提高了14%～172%和17%～69%，体外抗氧化活性分别提高了88%～178%和113%～139%；而始熟期末期(95%～100%果实转色)处理效果不明显。始熟期外源脱落酸处理对葡萄籽的酚类含量和抗氧化活性没有影响。

3)始熟期外源脱落酸处理可以提高葡萄果实和葡萄酒的花色苷总含量，果实和酒的花色苷的积累量分别增加了18%～143%和21%～46%。始熟期末期处理效果不够明显，而始熟期中期处理达到的效果最好，促进果实着色。

4)对于花色苷的组成，始熟期外源脱落酸处理使“美乐”成熟果实的3’-甲基花翠素糖苷比例降低11%～24%，乙酰化花色苷的比例升高19%～29%；使“赤霞珠”葡萄酒的香豆酰花色苷比例降低9%～14%，羟苯基吡喃型花色苷的比例降低6%～16%。总体来看，始熟期外源脱落酸处理对葡萄成熟果实和葡萄酒花色苷组成没有产生明显一致的影响。

本研究结果表明，始熟期中期前进行外源脱落酸处理可以显著提高葡萄果实和葡萄酒中酚类物质的含量及抗氧化活性，从而提升葡萄和葡萄酒的品质和营养价值。