阿胶的香气活性物质分析

随新平，朱庆珍，张 宁，陈海涛，孙阳恩，张雅丽，张 淹，刘海滨

(1.北京工商大学 北京市食品风味化学重点实验室， 北京 100048；2.北京工商大学 北京食品营养与人类健康高精尖创新中心， 北京 100048；3.北京工商大学 食品质量与安全北京实验室， 北京 100048；4.东阿阿胶股份有限公司 国家胶类中药工程技术研究中心， 山东 东阿 252201)

阿胶创于秦汉，始载于《神农本草经》[1]，是由马科动物驴的皮经熬煮浓缩而制成的胶状珍贵中药，富含明胶、蛋白质，氨基酸、多糖、挥发性物质及无机物等[2]，与人参、鹿茸并称为“滋补三宝”。其味甘，性平；归肺、肝、肾经；具有滋阴补血、润燥止血、美容养颜、益气助眠等作用[3]。

目前有关阿胶研究的文献，大部分主要集中在阿胶的疗效功能，有效物质的组成成分及其历史文化方面。临床验证了黄连阿胶汤具有治疗失眠的效用且效果显著[4-5]；药理研究表明阿胶具有增加白细胞[6]、补血造血[7]、抗衰老等作用。相对而言，目前对阿胶挥发性香气活性物质的研究较少。阿胶具有其独特的腥臭味，毛跟年等[8]经气相色谱- 质谱联用技术(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)检测到23种挥发性物质，其中异硫氰酸甲酯在所有挥发性物质中的相对含量较高,在阿胶腥味的构成中发挥着主要作用；张鹏云等[9]通过建立顶空固相微萃取- 气相色谱- 质谱(head space-solid phase microextraction-gas chroma-tography-mass spectrometry, HS-SPME-GC-MS)结合自动解卷积技术，经过优化确定了提取阿胶挥发性物质的较优条件，并在此条件下测定出了41种挥发性成分；王进等[10]通过同时蒸馏萃取法(simultaneous distillation and solvent extraction, SDE)提取阿胶中的挥发性成分，并结合GC-MS分析其挥发性成分，共鉴定出49种挥发性化合物，再经气相色谱- 嗅闻测定法(gas chromatography-olfactometry, GC-O)共鉴定出14种活性香气成分，证明了2-乙基-3,6-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、己醛、2,3-二甲基吡嗪和二甲基二硫醚为阿胶的关键风味物质。而采用SDE法提取基质中的挥发性成分，需使样品长时间处于高温状态，不适于热敏性香成分的检测，且极易造成风味失真。张晶等[11]采用顶空固相微萃取法(HS-SPME)并结合GC-MS从阿胶溶解物中鉴定出71种挥发性成分，但却没有明确指出影响阿胶风味的关键性风味物质。可见，针对阿胶香气活性物质的研究相对较少。

SPME法是食品中挥发性成分的常用萃取技术[12-13]，但其受样品量、萃取头、盐离子、萃取温度、萃取时间等因素的影响，难以获得全面的样品香气信息[14]。而溶剂辅助风味蒸发法(solvent-assisted flavor evaporation, SAFE)是一种在较低温度、高真空条件下，利用水或有机溶剂辅助挥发性风味物质快速蒸发，从复杂基质中温和而又高效的提取挥发性成分的方法，使萃取物更接近真实样品的风味[15-16]。已有研究通过对比SDE、HS-SPME和SAFE等3种萃取方法的萃取效果，发现SAFE法对挥发性风味物质的破坏较小、热敏性香味成分损失少[17-18]。将SAFE法和SPME法结合用于风味成分的萃取，将有助于进一步深入研究阿胶的挥发性风味成分。香气活度值法(odor activity value, OAV)是香气化合物浓度与阈值的比值，用于评价该成分对整体风味的贡献度。化合物的OAV大于等于1时，认为该化合物对整体风味有贡献作用，值越大则贡献度越大[19]，故可以通过OAV的大小，来确定阿胶中各风味物质对阿胶整体风味的贡献大小。

本研究采用感官分析法建立阿胶的风味轮廓图，采用SPME法和SAFE法提取阿胶中的挥发性成分，并结合GC-MS进行分析。针对两种不同的前处理方法，分别采用GC-O法和OAV法分析其关键性香气活性物质，同时考察所鉴定的香气化合物与阿胶风味轮廓的相关性。数据结果可为阿胶的风味数据和评价方法提供支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

东阿阿胶片，东阿阿胶股份有限公司，将阿胶块进行粉碎且过60目筛备用。

无水硫酸钠、二氯甲烷，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；邻二氯苯，色谱纯，美国Fisher-Chemical公司；C6～C30正构烷烃(质量分数≥99.0%)，美国 Sigma-Aldrich公司。

1.2 仪器与设备

DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器，巩义市予华仪器有限责任公司；溶剂辅助风味蒸发蝶形玻璃装置，莘县京兴玻璃器皿有限公司；EYELA型旋转蒸发仪，上海森信实验仪器有限公司；TRACE1310-ISQQD型气相色谱- 质谱联用仪，美国Thermo公司；ODP3型嗅闻检测器，德国Gerstel公司；手动SPME进样器、固定搭载装置及固相微黑色萃取头(75 μm Carboxen/PDMS)，美国Supelco公司。

1.3 实验方法

1.3.1感官分析

评价员筛选方法如下：感官评价在干净且无异味的房间中进行，让所有待选评价员对稀释一定浓度梯度的相关标品如己醛、丁酸、呋喃酮、糠醇等进行嗅闻，对能闻到气味且记录描述词相同或相似者定为合格。正式评价前让感官评价员熟悉阿胶的风味，能够对其作出客观评价。

感官分析方法采用0～4的5点制定量描述性感官分析法(0：没有香气；4：香气最强)。感官分析小组共6人，包括4名年龄在23～30岁的女性和2名年龄在23～30岁的男性。让其对筛选出的感官描述词采用5点制分别打分。所得结果取平均值。

1.3.2挥发性成分的萃取

SPME法提取阿胶挥发性风味成分：将SPME萃取头在气相色谱进样口于250 ℃老化30 min，在15 mL顶空进样瓶中加入阿胶粉1.0 g、内标邻二氯苯(用二氯甲烷稀释浓度至0.65 μg/mL，20 μL)，密封后于75 ℃水浴锅中平衡40 min；插入SPME萃取纤维顶空萃取，萃取时间40 min；然后将萃取头插入进样口，解析3 min，进行分析。

SAFE法提取阿胶挥发性风味成分：于锥形瓶中加入阿胶粉50 g，溶剂二氯甲烷200 mL，内标邻二氯苯250 μL(用二氯甲烷稀释浓度至2.6 μg/mL)，于室温下使用恒温加热磁力搅拌器(转速350 r/min)分3次进行萃取，每次萃取1 h，合并萃取液。将所得萃取液倒入SAFE装置的滴液漏斗中，水浴温度和超级恒温水槽的温度均为50 ℃，冷阱中加入液氮，待系统的绝对压强达到1×10-5MPa时，打开滴液漏斗活塞，缓慢滴加，萃取时间约为40 min。所得萃取液加入无水硫酸钠，于冰箱(-18 ℃)中冷冻干燥12 h后，旋蒸、氮吹至1 mL，密封后置于冰箱(-40 ℃)中保存，待分析使用。

1.3.3GC-MS分析条件

SAFE法GC条件：TG-wax型毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，载气为氦气，流速1.0 mL/min；进样量1 μL；分流比5∶1；气相进样口温度250 ℃。升温程序为起始温度40 ℃，保持1 min后，以2 ℃/min的速度升温至120 ℃，保持1 min，再以6 ℃/min的速度升温至220 ℃，保持5 min。

SPME法GC条件：进样方式为不分流进样，GC条件同SAFE法。

SAFE法MS条件：电子轰击(EI)离子源；电子能量70 eV；离子源温度280 ℃；质量扫描范围m/z35～550 u；扫描模式为全扫描；溶剂延迟时间7 min；调谐文件为标准调谐。

SPME法MS条件：无溶剂延迟时间，其余MS条件同SAFE法。

1.3.4GC-O分析条件

GC-O采用不分流进样，载气(He)流速1.66 mL/min，嗅闻系统传输线温度250 ℃, 嗅闻口温度220 ℃, 加湿器流速12 mL/min。其他条件与GC-MS条件保持一致。

对香气活性物质的分析采用强度法分析法。即嗅闻实验由6位经过训练的评价员完成，每位评价员对样品进行嗅闻，记录嗅闻过程中闻到气味的时间、香气特征及香气强度(1=微弱、2=清晰、3=较强、4=非常强烈)。须有4人以上嗅闻到的物质才能被确定为香气活性组分。

1.4 数据处理

定性分析：利用保留指数(retention index，RI)，并结合NIST14谱库检索进行定性分析。

将C6～C30正构烷烃混合物单独进样，进样量1 μL，升温程序和GC-MS检测条件一致。根据公式(1)计算保留指数：

(1)

式(1)中RI为保留指数；n为未知物流出前正构烷烃的碳原子数；t′(n)为具有n个碳原子的正构烷烃调整保留时间，min；t′(n+1)为具有n+1个碳原子的正构烷烃调整保留时间，min；t′(i)为待测组分的调整保留时间。

定量分析：采用内标法定量。以邻二氯苯为内标，根据内标物的浓度、样品中各组分的峰面积与内标峰面积的比值，计算出阿胶中各组分的含量。定量分析按式(2)和(3)计算。

(2)

式(2)中，Ai为待测物质的峰面积；A0为内标物邻二氯苯的峰面积；ρ0为内标溶液的质量浓度，μg/mL。

(3)

式(3)中，X为待测物质的含量，μg/g；ρi为待测物质的质量浓度，μg/mL；Vi为萃取液的体积，mL；n0/i为混合液中所含的内标物体积与萃取液体积之比；Ms为处理前样品的质量，g。

OAV计算：阈值是指引起人嗅觉感觉最小刺激的物质浓度，OAV是风味物质绝对含量与阈值的比值，其大小可以反映各物质对样品风味的贡献。按公式(4)计算OAV。

(4)

式(4)中，Ci为化合物的质量分数，μg/g；OTi为该化合物在水中的嗅觉阈值，mg/kg。

2 结果与分析

2.1 阿胶的风味轮廓分析

通过评价员对阿胶风味轮廓的分析，筛选出7个出现频率较高的描述词作为定量描述的依据，即：阿胶腥味、焦味、煳味、甜香、肉香、酸败和青香。感官分析结果见图1。可见，阿胶的风味主要呈现为其特征性的阿胶腥味、焦味和煳味，这与阿胶自身的理化属性及其制备工艺有关。此外，阿胶风味还呈现出一定的甜香、肉香和酸香，而青香的评分最低。

2.2 阿胶的挥发性成分分析

分别采用SPME与SAFE法提取阿胶中的挥发性成分，所得GC-MS分析结果见表1。

采用SPME和SAFE法结合GC-MS提取阿胶中的挥发性成分种类和质量分数见图2和图3。SPME法和SAFE法共检测到60种化合物。其中由SPME共检测到40种物质，其中酸类和含氮化合物各11种、醛类6种、醇类5种、酮类、杂环类和含硫化合物各2种、酯类1种。由SAFE共检测到47种物质，其中含氮化合物16种、酸类13种、醛类7种、醇类4种、杂环类3种、酮类和酯类各2种。两种方定性方法中，MS为质谱定性，RI为保留指数定性，S为标准品定性；“—”表示未在对应样品中检索到该物质。保留指数的文献值来源于NIST14谱库中的参考文献。

图1 阿胶的风味轮廓Fig.1 Flavor profile of Ejiao

表1 阿胶中挥发性成分的GC-MS分析结果Tab.1 GC-MS analysis results of volatile components in Ejiao

续表1

法共同检测到的挥发性化合物共有27种，大部分是酸类和含氮化合物，所检测到的其他种类化合物数量大致相同但重复性较差，说明采用两种方法分析阿胶风味具有互补作用。此外，因含硫化合物在样品中含量较低，SAFE法萃取过程中可能有一定的损失，并未检测到其存在，而SPME法较好地弥补了这一点。

图2 SPME法与SAFE法萃取阿胶中挥发性风味 成分的数量比较Fig.2 Comparison of number of volatile flavor components in Ejiao by SPME method and SAFE method

图3 SPME法与SAFE法萃取阿胶中挥发性风味成分的 含量比较Fig.3 Comparison of content of volatile flavor components in Ejiao by SPME method and SAFE method

由图2和图3可以看到，采用SPME法提取阿胶中的挥发性风味成分，质量分数最高的是含氮化合物(37.30%)，醇类(27.14%)次之，然后是醛类(14.76%)、酸类(13.45%)、杂环类(4.82%)、含硫化合物(1.31%)、酮类(0.87%)、酯类(0.34%)。采用SAFE法提取阿胶中的挥发性风味成分中，质量分数最高的是酸类(58.87%)，其次是含氮化合物(21.42%)，然后是醛类(8.39%)、杂环类(6.00%)、醇类(3.71%)、酮类(1.23%)、酯类(0.38%)。综上，可以看出，含氮类化合物对阿胶的风味具有重要的影响。

2.3 阿胶的香气活性物质分析

通过GC-MS测定，采用计算OAV的方法对阿胶关键性风味物质进行分析，结果见表2。

表2 OAV确定阿胶中的风味活性物质Tab.2 Determination of flavor active compounds in Ejiao by OAV

“—”表示未鉴定出。

由表2可知，经过SPME前处理的阿胶，在检测出的40中挥发性风味物质中，有24种化合物的OAV大于等于1，包括含氮化合物7种、醛类6种、酸类4种、醇类和含硫化合物各2种，酮类、酯类和杂环类各1种。OAV较大为含硫化合物、醛类和含氮化合物。其中二甲基三硫醚OAV(OAV=100 625)最大；其次是1-辛烯-3-醇(OAV=2 086)，3-乙基-2,5-二甲基吡嗪(OAV=1 453)、二甲基二硫醚(OAV=1 073)、庚醛(OAV=1 007)的OAV均大于1 000，这说明它们对阿胶的风味有重要贡献作用；反-2-辛烯醛(OAV=756)、戊醛(OAV=563)、辛醛(OAV=352)的OAV都大于100，故其对阿胶的风味也具有重要的贡献作用。由此可知，经SPME前处理的阿胶，再由OAV确定阿胶中的香气活性物质成分主要是含氮化合物、含硫化合物、醇类和醛类物质等。而经过SAFE前处理的阿胶，在检测出的47中挥发性风味物质中，有26种化合物的OAV大于等于1，包括酸类8种、含氮化合物7种、醛类6种、杂环类2种、酮类、醇类和酯类各1种。其中反,反-2,4-癸二烯醛OAV(OAV=16 494)最大；其次是3-乙基-2,5-二甲基吡嗪(OAV=1 023)；反-2-辛烯醛(OAV=503)、壬醛(OAV=409)、己醛(OAV=297)、庚醛(OAV=2 923)，2-戊基呋喃(OAV=283)、2-癸酮(OAV=259)和反-2-癸烯醛(OAV=257)这些化合物的OAV均大于100，说明其对阿胶风味具有重要影响作用。由此可以看出，经SAFE前处理的阿胶，再由OAV确定的阿胶中的香气活性成分主要是含氮化合物和醛类物质。综合两种前处理方法结果可知，共有33种化合物的OAV大于等于1，其中反,反-2,4-癸二烯醛、二甲基二硫醚、1-辛烯-3-醇、3-乙基-2,5-二甲基吡嗪、二甲基二硫化物和庚醛的OAV大于1 000，对阿胶的风味具有重要的贡献作用。张晶等[11]人对上海阿胶的研究中证明醛类化合物、酯类化合物和杂环类(吡嗪类、呋喃类)化合物为关键性风味物质的结论一致。

由表3可知，阿胶中的香气化合物主要呈现烤香、焦香、坚果香、油脂香、奶香、果香、花香等香气特征，其中，主要特征香气是烤香、焦香、油脂香和坚果香。SPME-GC-O和SAFE-GC-O共监测到35种风味化合物，其中通过SPME-GC-O检测到23种风味化合物，包括含氮化合物10种、酸类7种、醇类和醛类各2种、杂环类和含硫化合物各1种。其中，对阿胶整体风味贡献较大(强度≥ 3)的化合物有：2,5-二甲基吡嗪(炒花生、巧克力)、二甲基三硫醚(硫化物样、焦香)、3-乙基-2,5-二甲基吡嗪(土豆、烤香)、3,5-二乙基-2-甲基- 吡嗪(苦杏仁)、丁酸(酸败，奶酪，汗水)、糠醇(谷物、蒸米饭)、异戊酸(干酪、奶制品)、己酸(腐烂味、酸味)、2-吡咯烷酮(甜香、焦甜)等。由SAFE-GC-O检测到27种风味化合物，包括酸类10种、含氮化合物6种、酯类3种、醇类、酮类和杂环类各2种、烃类和醛类各1种。其中(强度=4)苯乙酸(花香、蜂蜜)、呋喃酮(焦甜)、2-乙基-3,6-二甲基吡嗪(土豆样)、异戊酸(干酪、奶制品)、丁酸(酸臭)、3,5-二乙基-2-甲基- 吡嗪(苦杏仁)、3-乙基-2,5-二甲基吡嗪(土豆、烤香)等对阿胶的风味贡献最大。这与王进等[10]人对三种不同品牌的阿胶的研究结果证明2-乙基-3,6-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、己醛、2,3-二甲基吡嗪为阿胶的关键性风味物质的结果有相似之处。2-吡咯烷酮可由γ-丁内酯氨化得到；含氮化合物主要通过美拉德反应生成，是阿胶中重要的风味物质。呋喃酮、(+)-柠檬烯等化合物，可能是其含量低于仪器检测限，故在GC-MS中未检出。

结合感官评价的结果，可以得出，阿胶的青香主要由醛类化合物如己醛等提供，酸败味主要由酸类化合物如异戊酸、己酸、壬酸等提供，此外，杂环类尤其含氮化合物如2-乙基-5-甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪等对阿胶的焦味和煳味具有重要贡献。

经OAV法和GC-O法共同确定的香气活性物质有：己醛、2-乙基-6-甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、3-乙基-2,5-二甲基吡嗪、糠醇、苯乙醇、2,5-二甲基吡嗪、二甲基三硫醚、2-乙基-5-甲基吡嗪、丁酸、4-甲基戊酸、异戊酸、己酸、辛酸、壬酸和γ-壬内酯。可见，这两种方法在鉴定阿胶风味活性物质方面具有一致性。此外，在GC-O中被鉴定为香气活性物质的(强度=4)苯乙酸、呋喃酮、2-乙基-3,6-二甲基吡嗪、2-吡咯烷酮、3,5-二乙基-2-甲基吡嗪，并没有在OAV中检出，但这些成分可能也对整体风味具有重要贡献作用，故两种方法可互为补充，以期全面对阿胶中的香气化合物进行鉴定。

3 讨 论

由GC-MS结果可知，SPME法和SAFE法共检测到60种化合物，其中SPME法检测到40种，SAFE法检测到47种。SPME法检测到含氮化合物11种，SAFE法检测到16种；SPME法检测到酸类化合物11种，SAFE法检测到13种；SPME法检测到醛类化合物6种，SAFE法检测到7种；SPME法检测到醇类化合物5种，SAFE法检测到4种；SPME法检测到酮类、杂环类和含硫化合物各2种；SPME法各检测到2种、3种和0种；SPME法检测到酯类化合物1种，SAFE法检测到2种。比较而言，SAFE法检测到的总化合物数量明显多于SPME法对样品中挥发性风味物质的提取，说明了SAFE法在对阿胶风味物质提取方面具有一定的优越性。

表3 GC-O法鉴定阿胶中的香气活性物质Tab.3 Identification of aroma active substances in Ejiao by GC-O

醛类物质的阈值较低，在阿胶中的含量也较高，主要呈现脂肪类香气、清香和果香，对阿胶的整体风味贡献较大。醛类化合物的生成途径主要是通过不饱和脂肪酸的氧化裂解，氨基酸反应及糖类降解也是其重要来源。己醛在所测得的醛类中含量最高，为阿胶提供青草、脂肪香味，也带有一定的腥味[21-22]。庚醛具有鱼腥、柑橘和蔬菜香味；壬醛赋予玫瑰香味；反-2辛烯醛和反，反-2,4-癸二烯醛的OAV很大，主要为阿胶提供青草香[23]和脂肪香[24]；苯甲醛具有杏仁、樱桃及坚果香气[25]；庚醛、辛醛、壬醛分别来源于亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸的氧化分解[26]，一般低级醛具有刺激味，高级醛具有水果味[27]，醛类还可进一步降解成其他香气物质的前体。

醇类化合物主要来自脂肪的氧化，其中1-辛烯-3-醇是亚油酸氧化的产物，是产生蘑菇、真菌气味的化合物[28]。苯乙醇存在于玫瑰油、苹果、蜂蜜等水果和天然加工产物中，具有令人愉悦的玫瑰花香，能掩盖阿胶中的异味。

酸类化合物，虽然其阈值较大，但其含量也较高，故OAV较大，对阿胶的风味具有贡献作用。含量最高主要是丁酸、己酸、辛酸等直链酸和异戊酸，酸类物质主要呈现一些不愉快的气味，其中辛酸呈异味和油脂味、己酸呈汗臭味[29]。酮类物质一般具有清香、果香和奶油气味，有些是生成杂环化合物的中间体，对香气的形成具有重要作用[30]，其中2-庚酮具有果香，并伴有药香香韵，广泛存在于芳香油、肉和乳酪中[31]。γ-壬内酯是由γ-羟基羧酸分子内酯化得到的内酯类化合物，是在阿胶中所测得的酯类中含量最高且OAV在两种前处理方法中都大于20的化合物，具有椰子和油脂的香气[32]。

含氮化合物经过OAV计算和嗅闻分析，发现含氮化合物中的吡嗪类化合物种类较多且其本身含量也较高，可能是因为制作阿胶的过程中涉及长时间的加热所以产生较多的吡嗪类化合物。吡嗪类化合物主要来自美拉德反应及氨基酸的热解，具有令人喜爱的焙烤香味，是焙烤食品中的重要呈香化合物[33]。2,6-二甲基吡嗪和2,3,5-三甲基吡嗪具有坚果、可可、烤牛肉和药草香[10]，在两种方法中均测得较高含量；2,5-二甲基吡嗪具有刺鼻的炒花生香气和巧克力、奶油气味[34]；2,3-二甲基吡嗪、3-乙基-2,5-二甲基吡嗪分别为阿胶提供坚果味[35]和烤香味[36]；杂环类化合物2-戊基呋喃主要来自亚油酸的氧化降解，具有豆香、果香和泥土的清香[37]。

含硫化合物主要来自阿胶中含硫氨基酸的分解，具有硫样气味，同时对肉香味具有贡献作用，为阿胶提供肉味和焦煳味。其中，二甲基二硫醚具有硫黄味、甜味、洋葱味，二甲基三硫醚具有硫黄味、焦香和大蒜味[38]，它们的阈值都很低，OAV分别高达100 625和1 073，说明二者对阿胶的风味均具有重要的贡献作用。

4 结 论

采用SPME和SAFE前处理方法提取东阿阿胶中的挥发性成分，经GC-MS法分别鉴定出40种和47种化合物，主要为醇类、醛类、酮类、酸类、酯类、含氮化合物和含硫化合物，两种方法共同检出化合物27种，包括苯乙醇、己醛、丁酸、γ-壬内酯、糠醇、2,5-二甲基吡嗪等。

经SPME和SAFE前处理的样品，通过OAV和GC-O分析共同确定其香气活性物质，结果显示：己醛、2-乙基-6-甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、3-乙基-2,5-二甲基吡嗪、糠醇、苯乙醇、2,5-二甲基吡嗪、二甲基三硫醚、2-乙基-5-甲基吡嗪、丁酸、4-甲基戊酸、异戊酸、己酸、辛酸、壬酸和γ-壬内酯为阿胶的关键性风味物质。研究结果可为阿胶香气活性物质的研究提供数据支撑。