基于网络药理学及分子对接探讨桑叶-菊花治疗高血压的作用机制

郭锦晨，王 茎，孙宇洁，冯 烨

1安徽中医药大学研究生院，合肥 230012；2安徽中医药大学新安医学教育部重点实验室，合肥 230038

高血压是一个由环境因素和遗传因素共同导致的多基因遗传性疾病，以体循环动脉血压升高为主要特征，可伴有心、脑、肾等器官的功能或器质性损害，是我国常见的心脑血管疾病之一，也是导致脑卒中、冠心病、心力衰竭的主要危险因素[1]。随着我国居民生活水平的日益提高，高血压呈不断增高趋势，如治疗不及时，严重影响人类健康与生命。中医学将高血压病归属于“头痛”“眩晕”“风眩”等范畴，病因病机多因脏腑气血阴阳失调，风、火、痰、瘀、虚相兼为患，正虚为本，邪实为标，临床上多呈虚实夹杂的致病特点。治疗上中药具有多效性、增效减副性、多靶点性、前瞻性等特点，能够保护高血压患者靶器官、减轻毒副作用、提高生活质量[2]，发挥着独特的优势作用。

桑叶(Folium Mori，FM)是桑科植物桑MorusalbaL.的干燥叶，菊花(Flos Chrysanthemi，FC)为菊科植物菊ChrysanthemummorifoliumRamat.的干燥头状花序。两者甘寒体轻，均入肺、肝二经，临床常协同为用，并走上焦疏风清热，同入下焦清热平肝、益阴明目，在《通俗伤寒论》羚角钩藤汤中二药为臣，平肝潜阳，清热息风，以助君药清热平肝之力。临床两者配伍常可用于治疗风热感冒、肺热咳嗽、温病初起、肝阳上亢头痛眩晕、目赤肿痛、目暗昏花、疮痈肿毒等，现代医家常取桑叶-菊花药对平肝清肝之功用于高血压的治疗，能够较好缓解高血压所引起的头痛、眩晕、目赤肿痛等症状[3]，但桑叶-菊花降压的药效物质基础和作用机制尚不明确，研究报道亦较少。为此，本研究采用网络药理学及分子对接方法，分析桑叶-菊花治疗高血压的药效物质基础，探究其降压的潜在分子作用机制，以期为相关的基础实验研究及临床应用提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 GEO芯片数据的获取与处理

GEO数据库(gene expression omnibus，https://www.Ncbi.Nlm.nih.gov/geo/)是美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)的基因表达综合库，以“hypertension/normal”为关键词，来源为“Homo sapiens”，从该数据库下载GSE75940基因表达谱的原始数据，所选取芯片利用R语言3.6.3进行数据标准化。从中筛选高血压样本4例，正常样本4例。所有样本均采用GPL13497[Agilent-026652 Whole Human Genome Microarray 4x44K v2(Probe Name version)]平台检测，根据平台注释信息将探针转化为基因名。

1.2 差异基因的筛选

芯片进行处理和转化后，利用R语言3.6.3(https://www.r-project.org/)中的limma包按照P-value<0.05，|log2FC|>0.5(FC表示差异表达基因上调或下调倍数)的筛选条件筛选高血压和正常动脉血管平滑肌细胞的差异表达基因，负数代表下调、正数代表上调，对差异基因进行聚类分析，利用R语言3.6.3中的pheatmap包绘制火山图。

1.3 桑叶-菊花药物活性成分及作用靶点的筛选

通过检索中药系统药理学分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)(http://lsp.nwsuaf.edu.cn/ tcmsp.php)检索桑叶、菊花的化学成分，以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和药物相似性(drug-like，DL)≥0.18作为筛选条件，时间截止至2020年4月7日，筛选出活性成分较高的化合物。

1.4 “化合物-靶点”的网络构建及可视化分析

从DrugBank数据库(https://www.drugbank.ca/)整合得到药物活性成分靶点，利用Venn在线软件(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)将药物与高血压差异表达基因相关靶点取交集，运用Cytoscape3.7.2(http:/ /www．cytoscape．org/)软件构建桑叶-菊花与高血压“化合物-靶点”网络并进行可视化分析。

1.5 蛋白网络互作构建及拓扑分析

利用Cytoscape 3.7.2软件中Bisogenet插件对桑叶-菊花与高血压关键靶点进行蛋白网络互作分析(protein-protein interaction，PPI)，再用CytoNCA插件对网络中所有点的拓扑参数度中心性(degree centrality，DC)、接近中心性(closeness centrality，CC)和介度中心性(betweenness centrality，BC)进行分析，借助网络拓扑理念筛选网络中的关键节点，筛选标准为DC大于所有节点2倍DC中位数，CC、BC大于所有节点对应值的中位数。

1.6 GO功能富集和KEGG通路分析

将关键靶点上传至David 6.8(Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery)数据库(https://david.ncifcrf.gov/，Version 6.8)，以人类为研究对象，进行基因功能(GO，gene ontology)分析以了解靶点主要的作用过程，主要包括生物过程(biological process，BP)，细胞组成(cellular component，CC)，分子功能(molecular function，MF)三方面。利用R语言3.6.3中的“clusterProfiler”包对关键靶点进行KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，https://www.kegg.jp/)富集分析，并使用“ggplot2”包绘制气泡图，clusterProfiler优势在于可以实时抓取KEGG最新版本注释得到更具时效性的富集注释结果。

1.7 分子对接验证

检索RSCB PDB数据库(http：//www.rcsb.org/pdb/home/home.do)并下载高血压靶蛋白的3D结构，检索并下载TCMSP数据库桑叶-菊花活性成分的2D结构，利用Chem3D进行结构优化。利用PyMOL 2.4.0软件对高血压靶蛋白进行除水、分离原配体等预处理。利用AutoDock的可视化软件AutoDock Tools 1.5.6软件设置GridBox各项参数，应用AutoDock Vina软件进行分子对接，最后运用PyMOL、LigPlot+软件对对接结果进行三维和二维可视化分析。

2 结果

2.1 高血压差异基因的筛选

基于GEO基因数据库GSE75940的基因片段原始数据，设置log2(fold change)的绝对值>0.5和P-value<0.05为筛选标准，总共得出5 989个高血压差异表达基因，其中包括2 864个下调基因和3 125个上调基因(见图1)；下调和上调最显著的40个基因见表1。

图1 高血压差异表达基因的火山图Fig.1 Volcano map of differentially expressed genes in hypertension

表1 高血压差异表达的上调下调基因Table 1 Up-regulated and down-regulated genes differentially expressed in hypertension

续表1(Continued Tab.1)

2.2 桑叶-菊花活性成分的筛选

在TCMSP中检索桑叶-菊花所有成分数据，根据口服生物利用度OB和药物相似性DL，同时筛去无对应靶点的成分，最终筛选出桑叶25个主要活性成分，菊花17个主要活性成分(见表2)。

表2 桑叶-菊花的有效活性成分Table 2 Active components of FM-FC

续表2(Continued Tab.2)

2.3 “化合物-靶点”的网络构建及可视化分析

将DrugBank数据库得到的所有靶点，删除重复并去除假阳性，整合得到桑叶、菊花活性成分作用靶点241个，与高血压差异表达基因相关靶点取交集得到基因靶点41个，涉及桑叶-菊花活性成分29个，通过Cytoscape 3.7.2软件构建桑叶-菊花与高血压“化合物-靶点”的可视化网络图(见图2)，主要活性成分有槲皮素、山奈酚、β-胡萝卜素、花生四烯酸、金合欢素、木犀草素等，关键基因有JUN、MMP9、PTGS2、EGFR、CCND1、MMP1、SPP1等。

图2 桑叶-菊花与高血压“化合物-靶点”的可视化网络图Fig.2 Visualized network diagram of "compound-target" between FM-FC and hypertension注：蓝色三角形节点代表作用靶点，椭圆形节点代表有效成分化合物(绿色为桑叶；黄色为菊花；红色为桑叶-菊花)。Note:The blue triangle node represents the action target,and the oval node represents the active ingredient compound (green is FM;yellow is FC;red is FM-FC).

2.4 蛋白网络互作构建及拓扑分析

利用Cytoscape 3.7.2软件中Bisogenet插件对41个关键靶点进行蛋白网络互作分析，得到由2 303个节点和45 586个边组成的网络，与高血压上调下调最显著的差异表达基因交集的有IGFBP5、KIF5C、SH2D2A、MEP1B、F2、PZP。再用CytoNCA插件对网络中所有点的拓扑参数(DC、CC和BC)进行分析，选择靶点DC值大于中位数2倍作为筛选核心靶点的条件，初步得到619个节点和20 405个边组成的网络，二次筛选以CC值>0.518得到310个节点和9 983个边组成的网络，最后BC值>147进一步筛选，构建了1个具有156个节点和3 808条边的桑叶-菊花与高血压的靶点网络(见图3)。拓扑分析出156个核心靶点信息，根据DC>185列举出前50个见表3。

图3 蛋白网络互作构建及拓扑分析Fig.3 Interaction construction and topological analysis of protein networks

表3 拓扑分析156个核心靶点信息(DC>185)Table 3 Topological analysis of 156 core target information (DC>185)

续表3(Continued Tab.3)

2.5 GO功能富集分析

利用DAVID平台进行GO功能富集分析，包括生物过程(BP)、细胞组分(CC)和分子功能(MF)3个分支，设定阈值P<0.05，对筛选得到的41个关键靶点进行分析(见图4)，这些靶点主要涉及对脂多糖的反应(response to lipopolysaccharide)、对平滑肌细胞增殖的正向调节(positive regulation of smooth muscle cell proliferation)、缺氧反应(response to hypoxia)等52条生物过程。CC分析可以看出靶点主要涉及细胞外空间(extracellular space)、内质网膜(endoplasmic reticulum membrane)、细胞膜筏(membrane raft)等15条细胞组分。MF分析中可以看出，靶点主要涉及酶结合(enzyme binding)、丝氨酸内肽酶活性(serine-type endopeptidase activity)、蛋白质均聚活性(protein homodimerization activity)等13条分子功能。

图4 桑叶-菊花活性成分治疗高血压靶点的GO富集分析Fig.4 GO Enrichment analysis of active components from FM-FC in treating hypertension

2.6 KEGG通路富集分析

使用clusterprofiler R包对41个关键基因进行KEGG通路分析，设定阈值为P<0.05，得到的39条KEGG通路富集，并绘制气泡图和通路-关键基因关系网络，结合表4和图5、图6，可知基因主要集中在IL-17信号通路(IL-17 signaling pathway)、流体剪切应力与动脉粥样硬化信号通路(Fluid shear stress and atherosclerosis)、催产素信号通路(Oxytocin signaling pathway)、TNF信号通路(TNF signaling pathway)等通路上，主要基因有JUN、PTGS2、MMP9、PRKCA、CCND1、EGFR、CASP8、ELK1等。

图5 KEGG通路富集分析气泡图(前20条)Fig.5 Bubble diagram of KEGG pathway enrichment analysis (top 20)

图6 KEGG通路-关键基因关系网络Fig.6 KEGG pathway-key gene relationship network

表4 KEGG通路富集分析(前20条)Table 4 Enrichment analysis of KEGG pathway (top 20)

2.7 分子对接分析

将槲皮素、山奈酚、β-胡萝卜素、花生四烯酸、金合欢素、木犀草素等桑叶-菊花的主要活性成分与JUN、PTGS2、MMP9、MMP1、CCND1等高血压核心靶点进行逐一对接，结合能小于0提示配体与受体可自发结合，且结合构象越稳定，所需结合能越低，≤-4.25 kcal/mol说明有一定结合活性，≤-5.0 kcal/mol说明有较好结合活性，≤-7.0 kcal/mol说明有强的结合活性(见图7)。本研究选取结合能<-9.0 kcal/mol作为筛选条件(见表5)，同时运用PyMOL和LigPlot+软件将结合能前5位的对接结果制作2D和3D对接示意图。综合分析，槲皮素、木犀草素可能是桑叶-菊花降压的关键活性成分。

表5 桑叶-菊花活性成分与靶点的结合能Table 5 Binding energy of active components of FM-FC to targets

图7 桑叶-菊花活性成分与靶蛋白对接二维及三维图(结合能≤9.8 kcal/mol)Fig.7 Two-dimensional and three-dimensional maps of docking between active components of FM-FC and target protein (binding energy ≤9.8 kcal/mol)注：A～E分别为氧化血根碱与PTGS2、木犀草素与MMP9、桑辛素D与PTGS2、桑辛素H与PTGS2、β-胡萝卜素与PTGS2的分子对接图。Note:A-E are molecular docking diagrams of sanguinarine oxide and PTGS2,luteolin and MMP9,moracin D and PTGS2,moracin H and PTGS2,and β-carotene and PTGS2,respectively.

3 讨论

高血压是脑卒中及冠心病发病的首要危险因素，是全球导致死亡的最重要因素之一，中医病因病机复杂，病机多见阴虚阳亢动风、痰湿瘀血阻滞等，病位多责之于肝、肾、脾，现代医学认为其发病受多个环节、多种机制(RAAS、氧化应激、炎症、神经-免疫因素、非编码RNA)和多种因素相互影响[4]。桑叶“乃箕星之精，箕好风，故善搜风”(《成方便读》)，菊花 “得金水之精英尤多，能益金水二脏也。补水所以制火，益金所以平木”(《本草纲目》)，桑叶、菊花是临床常用的经典药对，虽为轻平之品，但可益肺平肝，使肾水充足，涵养肝性，清泄肝热，常用治疗高血压引起的眩晕、头疼、急躁易怒、面红目赤等症，但具体药学物质和作用机制仍不清楚。本研究运用网络药理学研究模式，筛选出桑叶-菊花与高血压41个共同作用蛋白，涉及活性成分29个，拓扑分析出156个核心靶点信息，39条通路与高血压有关，体现了桑叶-菊花“多成分、多靶点、多途径”之间共同作用治疗高血压的机制。

根据表2、图2可知，治疗高血压的主要活性成分可能有槲皮素、山奈酚、β-胡萝卜素、花生四烯酸、金合欢素、木犀草素等，其中槲皮素、山奈酚为桑叶-菊花共有，槲皮素可减少氧化应激、干扰肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)和以内皮依赖性和改善血管内皮-1(ET-1)和NO平衡，从而改善血管内皮功能，降低血压[5]。山奈酚可内皮依赖性舒张血管，抑制血管紧张素Ⅱ导致的血管重构，还可通过抑制IKK/NF-κB炎症损伤IRS-1改善II型糖尿病大鼠的胰岛素抵抗，并对其具有调血脂作用[6]。β-胡萝卜素能降低低密度脂蛋白(LDL)氧化，消除自由基，预防血管损伤[7]。花生四烯酸是桑叶所含脂类，有防治动脉粥样硬化和抗血栓的作用[8]。金合欢素、木犀草素是菊花中含有的黄酮类化合物，菊花总黄酮可调节NO介导途径控制钙、钾离子通道，具有保护血管舒张反应性、扩张血管等作用[9]，木犀草素还具有清除自由基和保护细胞能力，且在体内与其他抗氧化剂协同显著增加抗氧化作用。此外，收集到主要活性成分治疗高血压靶点41个，涉及多个炎症、抗氧化、血管生成、血管重构等因子，表明了桑叶-菊花可通过多成分、多靶点发挥协同降压作用。

网络拓扑分析是从蛋白相互作用网络体系中多层次、多角度地挖掘相关信息，并从中筛选出具有特定信号节点的多靶点药物分子，为预测药物与疾病之间的相互关系提供参考[10]。本研究对41个关键靶点进行蛋白网络互作及拓扑参数分析，得到1个以EGFR、JUN、PRKCA为核心靶点的具有156个节点和3 808条边的靶点网络，一方面进一步筛选了关键靶点，一方面扩大了相关基因网络，为GO功能富集、KEGG通路分析和分子对接验证提供了佐证。根据拓扑分析结果表3、图3，结合表1和图2、6可知，其中关键作用靶点有JUN、MMP9、PTGS2、EGFR、CCND1、MMP1、SPP1、PRKCA、ELK1、IGFBP5、KIF5C、SH2D2A、MEP1B、F2、PZP等。研究表明，高血压发病机制主要与RAAS激活、交感神经活动亢进、胰岛素抵抗、水钠潴留、膜离子转运异常及血管内皮功能紊乱等有关[11]，导致血管收缩、损伤、重构，血压升高。其中，Jun激酶(JUN)通过转录调控调节VSMCs增殖、迁移、ROS产生和胞外基质降解的细胞过程的多种基因[12]。基质金属蛋白酶9(MMP9)参与正常生理过程中细胞外基质的分解，可通过释放血管内皮生长因子(VEGF)以参与血管生成，而基质金属蛋白酶1(MMP1)活性增高，高血压相关的微血管功能障碍的风险亦增高[13]。前列素内环氧化物合成酶2(PTGS2)是一种诱导性即刻反应基因，受到细胞因子、炎性介质、缺氧等刺激可迅速上调，主要产物前列腺素具有促进细胞增殖、促进血管生成等生物学活性[14]。表皮生长因子受体(EGFR)广泛分布于哺乳动物上皮细胞、成纤维细胞、角质细胞等细胞表面，对细胞的生长、增殖和分化等有重要作用，功能缺失或其相关信号通路关键因子活性异常，均会引起心血管疾病及免疫缺陷等发生[15]。周期蛋白D1基因(CCND1)具有调节细胞周期、细胞生长、细胞分化的作用，在细胞受到损伤时启动子上游的LncRNA的转录产物可与TNA结合蛋白TLS结合[16]。蛋白激酶C-α(PRKCA)基因是丝氨酸-苏氨酸特异性蛋白激酶C家族的成员，涉及血管平滑肌收缩和血管内皮生长因子通路，参与钙离子调控和血管平滑肌收缩[17]。分子对接进一步证实了网络药理学的成分筛选结果，结果表明潜在靶点PTGS2、MMP9、MMP1与槲皮素、木犀草素，PTGS2与山奈酚、β-胡萝卜素、金合欢素等具有较好的结合活性，而且结合体构象稳定，表明这些可能为桑叶-菊花治疗高血压的关键成分和靶点。

对关键靶点进行GO功能和KEGG通路富集分析，进一步探究桑叶-菊花治疗高血压的作用机制。结果发现，桑叶-菊花可能通过参与脂多糖的反应、对平滑肌细胞增殖的正向调节、缺氧反应、氧化还原过程、蛋白质分解代谢过程的调控等生物学过程，在细胞外空间、内质网膜、细胞膜筏等部位，发生酶结合、丝氨酸内肽酶活性、蛋白质均聚活性、血红素结合、蛋白质结合等分子反应，进而调控IL-17信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化信号通路、TNF信号通路、癌症中的微小核糖核酸信号通路等发挥降压作用。TNF、IL-17信号通路与炎症反应有关[18]，TNF信号通路异常调节会导致血管内皮细胞受损，平滑肌细胞增生，血管外周阻力增加而引起高血压，IL-17信号通路可诱导多种组织和细胞中促炎细胞因子、趋化因子和金属蛋白酶的表达[19]。流体剪切应力与动脉粥样硬化信号通路主要与血液流变学有关，较低的血流剪切力易导致动脉硬化形成或斑块破裂、内皮损伤，MMP-9、CRP水平升高，较高的血流剪切力有利于维持血管内皮的正常功能，保护血管内膜，防止高血压的发生[20]。microRNAs(miRNAs)是内源性非编码RNA小分子，主要在转录后水平调控基因表达，可以通过调控AT1R基因、盐皮质激素受体基因的表达，抑制RAAS的功能，减少水钠潴留，还可调控SRF、IRF、GAX等基因的表达，导致内皮功能紊乱，参与高血压的发生发展[21]。同时，PTGS2、JUN、MMP1、MMP9、CXCL2等关键靶点也显著富集在这些通路上，充分证明了桑叶-菊花具有多靶点、多通路协同增效的降压作用。

综上，本文采用网络药理学和分子对接的方法系统地分析了桑叶-菊花治疗高血压的分子作用机制，揭示了桑叶-菊花可能通过槲皮素、山奈酚、β-胡萝卜素、花生四烯酸、金合欢素、木犀草素等潜在药效成分，作用于JUN、MMP9、PTGS2、EGFR、CCND1、MMP1、PRKCA等多个靶点，通过IL-17信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化信号通路、TNF信号通路和癌症中的微小核糖核酸信号通路等，参与血管舒缩、钙钠离子转运、血管内皮功能、炎症反应、糖脂代谢和氧化应激等发挥降压的作用，证明了桑叶-菊花治疗高血压具有多成分、多靶点、多通路协同作用的特点,为进一步探讨其发挥作用的药效物质基础和作用机制研究提供方向，其后续尚需体内外实验进一步证实其功效网络的内在关联和作用靶点。