基于网络药理与分子对接技术的乌梅清润茶防治咽喉疾病作用机制研究

李 婧，张英秀，苏学燕，张志锋

(1.西南民族大学药学院，四川 成都610041；2.四川省羌彝药用资源保护与利用技术工程实验室，四川 成都610225)

随着环境污染及现代工作生活方式的改变，咽喉疾病成为一种发病率较高的疾病，常见的咽喉疾病包括有急慢性咽炎、咽喉炎、咽喉疼痛等，给人们的日常生活带来诸多不便.急性咽炎是咽部黏膜及黏膜下的非特异性炎症，与细菌、病毒感染以及环境因素有关，病变可以涉及邻近及周围的淋巴组织[1].慢性咽炎是咽部黏膜、粘膜下以及下淋巴组织的慢性炎症，发病率占咽喉疾病的10～20%，急性咽炎反复发作是导致慢性咽炎的主要原因[2-3].咽喉炎的主要症状包括咽痛、咽干、咽痒、咽部异物感、声音嘶哑等.该病目前西医治疗方式主要为抗菌消炎，但抗生素的使用容易产生耐药性，对疾病的临床疗效和转归产生影响，然而中成药治疗咽喉疾病以其作用温和持久、副作用小等特点日益受到广大患者关注.

中医学认为咽炎属“喉痹”的范畴，其病机分为外感和内伤两方面[4]，治疗应以清热解毒、消肿利咽为法.乌梅清润茶是由桔梗、甘草、青果、薄荷、乌梅、红茶等药材组成的一种中药代茶饮，具有疏风清热、利咽开音功效.用于风热犯肺引起的失音证、急慢性咽炎、咽喉疼痛的预防及辅助治疗.

中药具有多成分、多途径、多靶点的特点，“乌梅清润茶”由桔梗等6味中药组成，防治咽喉疾病的关键活性成分及作用机制尚不明确.网络药理学(network pharmacology)是通过建立“药物-成分-疾病-靶点”的网络关系，从而从整体预测分析药物作用靶点及作用机制的研究方法[5].因此，采用网络药理学方法研究乌梅清润茶防治咽喉疾病作用符合中药多成分多靶点的研究思路.分子对接技术是目前一种广泛应用的能快速准确地预测蛋白-配体复合物结合构象和亲和力并辅助筛选活性成分的重要研究技术[6].本研究采用网络药理学与分子对接技术相结合的方法(图1)，分析“乌梅清润茶”防治咽喉疾病作用机制及关键活性成分，为后续实验研究及临床应用提供参考.

1 材料与方法

1.1 乌梅清润茶活性成分及相关作用靶点的搜集

在中药系统药理学分析平台数据库(TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)中检索乌梅清润茶中桔梗、甘草、青果、薄荷、乌梅、红茶等6种药材的主要化学成分.以药物相似性(drug-likeness，DL)≥0.18、口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%为参考评估候选化合物.此外，在PubMed(https：//pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/)及CNKI(https：//www.cnki.net/)数据库中查阅文献搜集乌梅清润茶中6种药材主要活性成分，与在TCMSP数据库搜集到的活性成分进行整合并确证，建立“乌梅清润茶活性成分数据库”.在TCMSP数据库搜集上述活性成分的潜在作用靶点并进行整合，统一映射到Uniprot(http：//www.uniprot.org/)数据库为基因命名，建立“化合物-靶点”数据库.

图1 本研究整体流程图Fig.1 Flow chart of this study

1.2 咽喉疾病相关靶点的筛选

在OMIM数据库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/omim)及GeneCards数据库(https：//www.genecards.org/)中搜集与咽喉疾病相关的基因，以“acute pharyngitis”、“chronic pharyngitis”、“sore throat”、“laryngitis”、“hoarseness”为关键词进行检索，将两个数据库中得到的靶蛋白信息进行整合，与“1.1”中得到的乌梅清润茶活性成分作用靶蛋白采用R语言加载“VennDiagram”数据包取交集，得到共有差异表达基因，作为乌梅清润茶防治咽喉疾病潜在的作用靶蛋白.

1.3 蛋白互作网络(PPI)的构建及分析

String数据库(https：//string-db.org/)是一个能分析及预测蛋白质与蛋白质之间相互作用的数据库[7].将“1.2”乌梅清润茶防治咽喉疾病潜在靶蛋白ID输入到String数据库，物种设置为人，将得到的PPI关系数据导入Cytoscape(3.7.1)中，并根据degree值分析关键靶蛋白.

1.4 乌梅清润茶“成分-作用靶点”网络的构建与分析

Cytoscape是一种可视化软件，可直观地分析药物治疗疾病的作用机制.将乌梅清润茶活性成分以及潜在靶点信息导入Cytoscape中，构建“药材-成分-作用靶点”网络图.网络拓扑参数采用Cytoscape插件Network Analyzer进行分析.网络的化合物、靶点由节点(node)表示，连接的边(edge)表示这些节点分子之间的互作用.每个节点的重要性可以由拓扑参数自由度(degree)进行评估.节点的degree为与节点相连的边的数量，degree越大的节点在网络中越重要.

1.5 生物过程(GO)与KEGG通路分析

生物学信息注释数据库(DAVID，https：//david.ncifcrf.gov/)可以为蛋白或基因或蛋白富集最显著的生物学注释.将“1.2”中乌梅清润茶作用潜在靶基因ID导入DAVID(6.8)数据库，对乌梅清润茶作用靶点可能存在的生物过程(BP，biological process，)、分子功能(MF，molecular function)及细胞组分(CC，cellular component)进行生物过程GO富集分析(p＜0.05).此外，对潜在靶基因进行KEGG通路富集分析(p＜0.05)，利用ImageGP工具绘制气泡图.

1.6 分子对接技术分析关键活性成分

在RSCB PBD数据库(http：//www.rcsb.org/pdb/home/home.do)中下载“1.3”中关键靶蛋白的PDB结构，采用AutoDock及ToolsPyMOL(Version 1.5.6)软件对大分子受体蛋白及小分子配体进行去水、加氢、加电荷等前处理.根据文献或根据靶蛋白复合物中配体的坐标寻找分子对接的活性位点.采用AutoDock Vina进行分子对接，根据靶蛋白与配体的结合能大小判断其亲和力，结合能越小，亲合力越大.利用ImageGP(http：//www.ehbio.com/ImageGP/)工具绘制分子对接热图，分析乌梅清润茶关键活性成分.

2 结果

2.1 乌梅清润茶活性成分筛选

将在TCMSP数据库中筛选得到的乌梅清润茶活性成分与文献收集的主要成分及相整合，共得到108个成分，去除重复成分14个，共得到94个活性成分.其中桔梗9种、甘草44种、青果10种、薄荷13种、乌梅12种、红茶6种.活性成分见表1.

表1 乌梅清润茶主要活性成分Table 1 Main active ingredients in Wumei Qingrun tea

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2.2 乌梅清润茶防治咽喉疾病靶点预测

在TCMSP中收集上述94种候选化合物的蛋白靶点，并统一映射到Uniprot数据库中获取基因名，去除重复靶点，共得到339个靶点.将上述靶点基因与在OMIM及GeneCards数据库检索到的咽喉疾病相关的基因取交集，得到共有差异表达基因，韦恩图见图2，得到乌梅清润茶防治咽喉疾病的潜在作用靶蛋白共193个.

图2 乌梅清润茶与咽喉疾病靶点韦恩图Fig.2 Venn diagram analysis of Wumei Qingrun tea with Pharynx-Larynx Diseases

2.3 PPI网络构建及作用关键靶蛋白分析

通过String在线工具对上述193个潜在靶蛋白进行PPI网络构建，采用Cytoscape作图并分析PPI互作关系，采用R语言对排名前20的关键靶蛋白做柱状图分析，见图3.图中节点表示靶蛋白，靶蛋白之间的关联用边表示，共涉及193个节点，8 624个边，其中degree较大的靶点圆形较大.通过柱状图可见INS、AKT1、IL6、VEGFA、MAPK3、CASP3、EGFR、CXCL8、MAPK8等20个基因degree较高(degree＞88)，可能作为关键靶基因进行进一步研究.

图3 乌梅清润茶PPI互作及关键靶点图A.PPI互作图；B.排名前20关键靶点Fig.3 Protein interaction networkand the key target of Wumei Qingrun tea A.PPI network；B.top 20 key targets

2.4 乌梅清润茶“活性成分-靶点”的网络构建与分析

将乌梅清润茶活性成分与潜在靶点信息导入至Cytoscape软件，构建“活性成分-靶点”网络，见图4.由图可见，该网络共有270个节点及1 668条边，红色表示乌梅清润茶活性成分，蓝色表示靶蛋白，边表示相互之前的关系.网络中节点进行拓扑参数进行分析结果显示，化合物的平均度数(degree)为6.18，提示每个活性成分可作用于多个靶点，乌梅清润茶防治咽喉疾病具有多成分、多靶点特点.网络分析显示quercetin、naringenin、luteolin、ursolic acid、beta-sitosterol、kaempferol等成分degree较高，degree排名前20的成分可以作为乌梅清润茶防治咽喉疾病关键活性成分进一步研究，degree前20的活性成分及相关参数见表2.

图4 乌梅清润茶化合物-靶点网络红色代表代茶饮活性成分，蓝色代表靶点蛋白，边代表相互关系Fig 4 Components-targets network of Wumei Qingrun tea The red is the active ingredients of Wumei Qingrun tea，the blue is the targets and the line is the relationship of ingredient-target

表2 乌梅清润茶中degree排名前20的关键活性成分信息Table 2 Basic information of the top 20 main active ingredients in Wumei Qingrun tea

OB：生物利用度oral bioavailability；DL：药物相似性drug-likeness

2.5 活性靶点生物学功能GO及KEGG通路富集分析

将“2.2”项中得到的乌梅清润茶193个潜在靶基因ID导入DAVID数据库，对乌梅清润茶作用可能存在的生物过程(BP)、分子功能(MF)及细胞组分(CC)进行生物过程GO富集分析(p＜0.05)，GO功能富集分析得到GO条目720个(p＜0.05)，其中生物过程(BP)条目541个，分子功能(MF)条目111个，细胞组成(CC)条目68个，取排名前10的条目作图，见图5.结果提示乌梅清润茶可能是通过调节对药物、脂多糖的反应等生物过程，调控细胞外间隙、胞外区及细胞质等细胞成分，调节酶结合、蛋白质结合等分子功能发挥防治咽喉疾病的作用.

KEGG通路富集筛选得到131条信号通路(P＜0.05)，选取前20条通路作图(见图6).其中乌梅清润茶作用涉及信号通路包括TNF信号通路、HIF-1信号通路、Toll-like receptor信号通路、T cell receptor信号通路、NF-κB信号通路、FoxO信号通路、PI3KAkt信号通路、NOD-like receptor信号通路、VEGF信号通路等.

图5 乌梅清润茶防治咽喉疾病潜在作用靶点GO基因功能分析Fig.5 GO analysis of potential targets of Wumei Qingrun tea for treating Pharynx-Larynx Diseases

图6 乌梅清润茶防治咽喉疾病潜在靶点KEGG通路富集分析Fig.6 KEGG pathway analysis of potential targets of Wumei Qingrun tea for treating Pharynx-Larynx Diseases

2.6 分子对接

选择“2.3”项中得到的排名前10的关键靶点INS、AKT1、IL6、VEGFA、MAPK3、CASP3、EGFR、CXCL8、MAPK8及MAPK1，将“2.4”项中得到的前20个潜在活性成分作为配体与上述10个靶点分别进行分子对接，结合能越低，受体配体亲合力越强.对接结果热图如图7.从图中可见，quercetin、beta-sitosterol、fortunellin、aloe-emodin等成分与AKT1结合自由能较低，说明与该靶点可能具有一定亲合力；ursolic acid、fortunellin等成分与VEGFA及EGFR有一定亲合力；luteolin、ellagic acid等成分与MAPK8有一定亲合力.部分活性成分分子对接图如图8.

图7 乌梅清润茶潜在活性成分结合能热图Fig.7 Heat map of binding energy of potential active components in Wumei Qingrun tea

图8 部分关键靶蛋白与乌梅清润茶中关键活性成分分子对接模式Fig.8 Molecular docking diagram of key target proteins and key active ingredients in Wumei Qingrun tea

3 讨论

乌梅清润茶对咽喉疾病具有防治作用，甘草甘平解毒而泻火，桔梗开音利咽，并有载药上行之力，薄荷清新怡神，疏风散热，硝和盐水浸梅子以增强生津液，润喉咙，消肿痛的作用.青果性平，入脾、胃、肺经，该药具有清热解毒、生津止渴、利咽化痰的功效功，适用于烦渴、咽喉肿痛、咳嗽痰血等.因此诸药合用，具有疏风清热、利咽开音功效.然而其配伍成分复杂，具有多成分、多靶点的特性，其作用机制尚不明确，本文对乌梅清润茶防治急、慢性咽炎、咽喉疼痛、声音嘶哑等咽喉疾病作用机理进行了分析，并对其活性成分进行了筛选.本研究首先对乌梅清润茶防治咽喉疾病活性物质进行了挖掘，纳入的94个成分中包括了从TCMSP数据库搜集得到满足OB、DL要求的59个化合物以及从文献中搜集到的35种各药材主要活性化合物.理论上，活性成分理想的条件为OB≥30%，DL≥0.18，本研究为搜集更多潜在活性成分，我们纳入了ursolic acid、epicatechin、caffeine、rosmarinic acid、oxalic acid、gallic acid等化合物，这些化合物OB或DL值不符合纳入标准或者没有被TCMSP检索，但根据文献报道这些成分都是乌梅清润茶几种药材中具有抗咽炎、抗炎的主要活性成分，因此也被纳入本研究.例如，文献报道ursolic acid是一种天然的三萜化合物，存在于各种水果和蔬菜中，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、抗肿瘤等多种作用[8].Rosmarinic acid可以通过调节Nrf2/HO-1和TLR4/NF-κB通路抑制氧化应激和炎症[9].Caffeine具有抗氧化和抗炎作用，这些作用对人类健康极为重要，并以剂量依赖的方式改变细胞氧化还原和炎症状态[10].我们的研究结果显示以上化合物在我们的化合物-靶点网络中具有较高的degree值，是乌梅清润茶的重要活性物质，与已有文献报道相符，因此将以上化合物纳入研究是有必要的.

本研究通过将“活性成分-靶点”进行可视化，体现了乌梅清润茶多成分、多靶标防治咽喉疾病的特点.本研究结果提示乌梅清润茶中quercetin、ursolic acid、beta-sitosterol、fortunellin、aloe-emodin，naringenin、luteolin、ellagic acid等多种成分可通过调控TNF、HIF-1、Toll-like receptor、T cell receptor、NF-κB、FoxO、PI3K-Akt、NOD-like receptor、VEGF等信号通路发挥防治咽喉疾病的作用.然后我们采用分子对接方式对预测的关键成分与关键靶点亲合力进行了验证，筛选出quercetin、ursolic acid等多个潜在活性成分.文献报道表明luteolin与Polysaccharides联合可以通过抑制NF-κB通路和M1巨噬细胞极化而减轻慢性咽炎[11].Quercetin可以通过下调NF-κB等信号通路抑制TNF-α诱导的凋亡和炎症[12].Ursolic Acid可能通过调控High Mobility Group Box 1/Toll-like receptor 4/NF-κB通路减轻炎症反应.Fortunellin可以通过调控AMPK/Nrf-2途径抑制炎症和氧化应激[13].此外，筛选得到的beta-sitosterol、kaempferol、aloe-emodin、ellagic acid等多种成分都被报道具有抗炎或抗咽炎作用[14-17].以上报道均与本研究预测分析的活性成分及通路通路相关，说明本研究分析结果有一定的可信度.

本研究结果提示乌梅清润茶中quercetin、ursolic acid、beta-sitosterol、fortunellin、aloe-emodin，naringenin、luteolin、ellagic acid等多种成分可通过作用于INS、AKT1、IL6、VEGFA、MAPK3、CASP3、EGFR、CXCL8等靶基因，通过调节对药物、脂多糖的反应等生物过程，调控细胞外间隙、胞外区及细胞质等细胞成分，调节酶结合、蛋白质结合等分子功能，通过调控TNF、HIF-1、Toll-like receptor、T cell receptor、NFκB、FoxO、PI3K-Akt、NOD-like receptor、VEGF等信号通路发挥防治咽喉疾病的作用.然而，由于数据库和计算软件本身的局限性，结果可能与临床疗效存在一定的差异，有待进一步验证研究.中医药是有待现代医学发掘的“最大宝库”，本研究为“乌梅清润茶”的合理应用提供了科学的数据，也为咽喉疾病防治和治疗药物的研发提供新方向及依据.