lncRNA CASC9和miR⁃758⁃3p在肝细胞肝癌血清中的表达及诊断价值

陆秀琴 葛国洪 潘洪秋 王健

1上海健康医学院（上海201318）；2镇江市第三人民医院肝病科（江苏镇江212021）；3上海交通大学医学院附属新华医院移植科（上海200082）

肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是高度致命的恶性肿瘤，是全世界与癌症相关死亡的第四大原因［1］，且其发病率还在呈增加的趋势［2］。由于早期缺乏特异性的临床症状，大多数HCC患者确诊时已处于晚期，错过了进行根治性治疗的最佳时机，这类患者即使积极进行了各种治疗，其总体的预后情况依然很差［3］。目前检测血清中甲胎蛋白（α⁃fetoprotein，AFP）的表达是HCC早期筛查的重要方法，但是分化成熟的肝细胞增生也可合成AFP，AFP 在肝硬化、肝炎等肝脏损伤所致肝细胞代偿性增生的情况下会分泌增多，因此AFP 对HCC 的诊断价值还有待进一步提升［4］。研究报道长链非编码RNA 肿瘤易感候选者9（long non⁃coding RNA cancer susceptibility candidate 9，lncRNA CASC9）在HCC 患者血清中高表达与患者不良病理分期相关［5］。长链非编码RNA（long non⁃coding RNA，lncRNA）调控恶性肿瘤进展的重要分子机制是作为微小RNA（microRNA，miRNA）的内源竞争RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）发挥重要作用［6］。HU 等［7］报道在卵巢癌中lncRNA CASC9 通过抑制miR⁃758⁃3p 的水平促进卵巢癌的生长。研究报道miR⁃758⁃3p 可以抑制HCC 患者细胞的增殖、迁移和侵袭能力［8］。从肥胖到代谢综合症的进展过程中，miR⁃758⁃3p 具有作为一种基于血液的生物标记物的潜力［9］。而miR⁃758⁃3p 在HCC 患者血清中表达的意义未知。本研究旨在分析HCC 患者血清中lncRNA CASC9 和miR⁃758⁃3p的表达及其与患者临床病理特征的关系，并探讨了两者联合AFP 能否提高对HCC 早期诊断价值，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料选取2018年6月至2020年2月于镇江市第三人民医院行手术治疗或者穿刺诊断的HCC 患者72 例，将其纳入到HCC 组。纳入标准：（1）入组前未经放化疗或者靶向等治疗，术后或者穿刺病理确诊为HCC；（2）临床资料完整；（3）患者对本次研究内容知情同意。排除标准：（1）合并有肺癌、卵巢癌等其他恶性肿瘤者；（2）合并自身免疫性疾病、血液系统疾病者；（3）妊娠或哺乳期妇女。患者年龄33～79岁，平均年龄（56.62±15.30）岁，＞56 岁者40 例，≤56 岁者32 例；男49 例，女23 例；肿瘤大小：＞5 cm 26 例，≤5 cm 46 例；肝硬化：有46 例，无26 例；淋巴结转移20 例，无淋巴结转移52例；TNM分期：Ⅰ期27例，Ⅱ期20例，Ⅲ期16例，Ⅳ期9 例；血清AFP（ng/mL）：＞200 为41 例，≤200为31 例。

选择同期于我院行健康体检人员30 例作为健康对照组，年龄28～72 岁，平均（55.08 ± 16.88）岁。男18 例，女12 例。所有患者均签署书面知情同意书，本研究已得到我院伦理审查委员会的批准，且遵循赫尔辛基宣言。

1.2 实验试剂与仪器无RNA 酶PCR 管、EP 管和枪头等购于美国KIRGEN 公司；血清RNA 提取试剂盒购于德国QIAGEN 公司；DEPC 水购于北京索莱宝试剂公司；lncRNA CASC9、miR⁃758⁃3p 和内参U6 引物购于美国invitrogen 公司；ULtraRT one step RT⁃PCR 试剂盒购自北京百奥莱博；Nanodrop2000购于美国Thermo 公司；7500 荧光定量PCR 仪购于美国BIO⁃RAD 公司。

1.3 实时定量聚合酶链式反应（real⁃time quanti⁃tative polymerase chain reaction，qRT⁃PCR）抽取纳入研究患者的静脉血4 mL，室温静置2 h 左右至血液完全凝固及分层后，以2 500 r/min 离心10 min。可见液体分为两层，将上层上清液1 mL左右吸至EP 管中，放于液氮中保存备用。将收集的血清加至QIAzol 裂解液中溶解，加入氯仿溶液，混匀后低温高速离心30 min，可见液体分成水相和有机相。RNA 位于上层水相，将上层上清液移至新的EP 管中，加入无水乙醇后经RNeasy MinElute离心柱过滤、DEPC 水洗脱后获得血清中总RNA。采用Nanodrop2000 测得RNA 浓度，放于-80 ℃冰箱中保存备用。

按照ULtraRT one step RT⁃PCR 试剂盒说明书进行试剂的配制，RNA 质量为1 μg（按照浓度计算体积）、2×Ultra RT one step Buffer 12.5 μL、上下游引物各1 μL、Ultra RT one step EnzymeMix 0.5 μL、无RNA 酶的双蒸水补足25 μL。45 ℃30 min 进行反转录反应，95 ℃预变性2 min，94 ℃变性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，变性退火延伸共40个循环，终延伸72 ℃5 min。采用2⁃ΔΔCt法以GAP⁃DH 基因为内参计算lncRNA CASC9 和miR⁃758⁃3p的相对表达量。

lncRNA CASC9 引物F：5′⁃TTGGTCAGCCACA⁃TTCATGGT⁃3′，R：5′⁃AGTGCCAATGACTCTCCAGC⁃3′，以GAPDH 为内参，GAPDH 引物F：5′⁃GCACC⁃GTCAAGGCTGAGAAC⁃3′，R：5′⁃TGGTGAAGACGC⁃CAGTGGA⁃3′；miR⁃758⁃3p 引物F：5′⁃ACACTCCAG⁃CTGGGTTTGTGACCTGGTCCA⁃3′，R：5′⁃CTCAACT⁃GGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGGTTAG⁃TG⁃3′，以U6 为内参，U6 引物F：5′⁃CTCGCTTCGGC⁃AGCACA⁃3′，R：5′⁃AACGCTTCACGAATTTGCGT⁃3′。

1.4 统计学方法使用SPSS 23.0进行研究资料分析。观测资料主要为计量数据，以（）描述。两组间的比较为成组t检验或校正t检验。基线资料中的计数资料以例（%）描述。两组间比较为χ2检验。ROC 曲线分析诊断价值。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 lncRNA CASC9 和miR⁃758⁃3p 的结合位点预测采用starBase v2.0 在线软件（https：//bigd.big.ac.cn/databasecommons/database）预 测lncRNA CASC9与miR⁃758⁃3p 的结合位点，结果显示lncRNA CASC9 与miR⁃758⁃3p 存在潜在的互补结合位点，见图1。

图1 StarBase v2.0 在线软件预测lncRNA CASC9 与miR⁃758⁃3p 的结合位点Fig.1 StarBase v2.0 online software predicts the binding sites of lncRNA CASC9 and miR⁃758⁃3p

2.2 lncRNA CASC9和miR⁃758⁃3p在HCC血清中的表达与健康对照组相比，lncRNA CASC9在HCC组血清中的表达显著增加（P＜0.05），miR⁃758⁃3p在HCC组血清中的表达显著降低（P＜0.05），见表1。

表1 两组血清中lncRNA CASC9、miR⁃758⁃3p 表达水平Tab.1 Expression levels of lncRNA CASC9 and miR⁃758⁃3p in serum of two groups

2.3 HCC 患者血清中lncRNA CASC9、miR⁃758⁃3p 表达水平与患者临床病理参数之间的关系lncRNA CASC9、miR⁃758⁃3p 在HCC 血清中的表达水平与患者的年龄、性别、肿瘤大小和血清AFP 均无关（P＞0.05），与患者的肝硬化、淋巴结转移和TNM 分期有关（P＜0.05）。见表2。

表2 lncRNA CASC9 和miR⁃758⁃3p 在HCC 血清中的表达水平与临床病理参数之间的关系Tab.2 Relationship between the expression levels of lncRNA CASC9 and miR⁃758⁃3p in serum of HCC and clinicopathological parameters ±s

表2 lncRNA CASC9 和miR⁃758⁃3p 在HCC 血清中的表达水平与临床病理参数之间的关系Tab.2 Relationship between the expression levels of lncRNA CASC9 and miR⁃758⁃3p in serum of HCC and clinicopathological parameters ±s

临床病理参数年龄≤56 岁＞56 岁性别男 女肿瘤大小＞5 cm≤5 cm肝硬化有 无淋巴结转移无 有TNM 分期Ⅰ+Ⅱ期Ⅲ+Ⅳ期AFP＞200 ng/mL≤200 ng/mL例数32 40 49 23 26 46 46 26 52 20 47 25 41 31 lncRNACASC9 1.80±0.50 1.87±0.48 1.88±0.48 1.75±0.47 1.99±0.56 1.76±0.53 1.92±0.51 1.70±0.27 1.71±0.52 2.19±0.40 1.73±0.55 2.05±0.46 1.76±0.47 1.94±0.52 t 值0.604 0.609 1.733 2.392 3.720 2.482 1.537 P 值0.548 0.544 0.087 0.019＜0.001 0.015 0.129 miR⁃758⁃3p 0.79±0.31 0.75±0.28 0.74±0.29 0.83±0.30 0.70±0.29 0.81±0.37 0.71±0.31 0.88±0.27 0.83±0.29 0.61±0.33 0.86±0.30 0.60±0.22 0.80±0.29 0.74±0.26 t 值0.440 1.284 1.305 2.338 2.774 3.817 0.908 P 值0.661 0.203 0.196 0.022 0.007＜0.001 0.367

2.4 血清中lncRNA CASC9、miR⁃758⁃3p 和AFP的表达水平对HCC 诊断的价值进一步探讨血清中lncRNA CASC9、miR⁃758⁃3p 和AFP 等3 指标对HCC 的诊断价值。

2.4.1 各指标的单独应用以HCC 患者组为阳性样本，以健康对照组为阴性样本，建立ROC 诊断分析模型。经ROC 分析知：各指标对HCC 均有一定的诊断价值，ROC⁃AUC 分别为0.745（95%CI：0.632～0.879）、0.762（95%CI：0.641～0.907）、0.797（95%CI：0.707～0.899），见表3，ROC 分析曲线见图2。

2.4.2 三指标的联合应用采用SPSS 软件的联合应用ROC 理论模式：LogP 模式。结果显示：联合应用对HCC 的诊断价值比各单一指标均有明显提高，ROC⁃AUC 为0.848（95%CI：0.767～0.937），见表3、图2。

表3 血清中lncRNA CASC9、miR⁃758⁃3p 和AFP 指标对HCC 诊断价值之ROC 分析结果Tab.3 ROC analysis results of serum lncRNA CASC9，miR⁃758⁃3p and AFP in the diagnosis of HCC

图2 ROC 分析曲线Fig.2 ROC analysis curve

3 讨论

肝癌是全球常见肿瘤相关死亡原因，每年约有85 万例新发病例［10］。HCC 是人类肝脏中的最常见肿瘤，约占所有原发性肝癌病例的90%，中国由于乙型肝炎病毒的流行，HCC 更为常见［11］。在HCC 的临床治疗中已采用了包括药物干预、化学栓塞和外科治疗在内的许多治疗策略，但由于HCC 的异质性、复杂性和高复发，患者的病死率依然较高［3］。HCC 发生进展的潜在分子机制目前仍未完全阐明，lncRNA 是长度超过200 个核苷酸的非编码RNA，在包括表观遗传修饰、转录调控和转录后修饰等多种机制中具有调控功能［6］，近年来发现了大量与HCC 相关的lncRNA，并有部分可作为肿瘤早期诊断和预后的分子标志物［12］。

本研究首先采用qRT⁃PCR 检测血清中lncRNA CASC9 的表达水平，结果显示lncRNA CASC9 在HCC 患者血清中表达增加，且与患者的年龄、性别、肿瘤大小和血清AFP 无关，与患者的肝硬化、淋巴结转移和TNM 分期相关。而ZENG 等［5］报道HCC 患者血清中lncRNA CASC9 的高表达与肿瘤大小、淋巴结转移、TNM 分期、分化程度和AFP 相关，高表达lncRNA CASC9 的HCC 患者预后较差。本研究结果与ZENG 等［5］的研究均显示lncRNA CASC9 参与HCC 的恶性进展，但是病理参数的相关性并不完全一致，分析原因可能与收集样本例数的多少以及来源不同有关。lncRNA CASC9 是位于8q21.1 号染色体上的基因，研究报道lncRNA CASC9 在多种类型的人类肿瘤中发挥促癌作用，包括结直肠癌［13］、甲状腺乳头状癌［14］和乳腺癌［15］等，在这些肿瘤中lncRNA CASC9 高表达与肿瘤患者的不良病理参数相关，在细胞体外实验中ln⁃cRNA CASC9 促进肿瘤细胞的增殖和转移能力，这些研究均提示lncRNA CASC9 是一种促癌因子。lncRNA 调控miRNA 的表达是参与肿瘤恶性生物学行为的重要作用分子机制［16］。研究报道在卵巢癌中lncRNA CASC9 作为miR⁃758⁃3p 的ceRNA 发挥促癌作用［7］。本文采用StarBase v2.0 软件提示lncRNA CASC9 与miR⁃758⁃3p 存在潜在的结合位点，提示两者在HCC 中可能存在调控关系。本研究通过qRT⁃PCR 检测显示，miR⁃758⁃3p 在HCC 患者血清中的表达显著低于在对照组血清中的表达，且与患者的肝硬化、淋巴结转移和TNM 分期相关，表明miR⁃758⁃3p 可能具有抑制HCC 进展的作用。细胞实验发现［8］，miR⁃758⁃3p 可通过抑制小鼠双微体2、雷帕霉素靶蛋白的表达抑制HCC 的增殖、转移和侵袭。还有相关研究显示，miR⁃758⁃3p 可抑制膀胱癌［17］、甲状腺乳头状癌［18］、胃癌［19］等肿瘤的恶性进展，提示miR⁃758⁃3p 是一种抑癌因子。

由于外周血游离核酸检测具有局部微创、操作简单和成本低等优点，广泛应用于各种疾病的诊断和预后［20］。目前AFP 是诊断HCC 早期的公认肿瘤标志物［4］，但其诊断价值还有待进一步提升。本研究通过ROC 分析显示，lncRNA CASC9、miR⁃758⁃3p 与AFP 对HCC 均有一定的诊断价值，ROC⁃AUC 分别为0.745（95%CI：0.632～0.879）、0.762（95%CI：0.641～0.907）、0.797（95%CI：0.707～0.899），然而指标单独检测通常存在一定的缺陷，目前联合检测已成为趋势。本研究发现，lncRNA CASC9、miR⁃758⁃3p 与AFP 联合检测HCC 诊断的敏感度和特异性均高于各指标的单独检测，ROC⁃AUC 为0.848（95%CI：0.767～0.937），提示lncRNA CASC9 和miR⁃758⁃3p 的联合检测在HCC 的诊断中具有重要指导意义。

综上所述，血清lncRNA CASC9 和miR⁃758⁃3p在HCC 中均异常表达，二者的表达水平与肝硬化、淋巴结转移和TNM 分期有关，二者可能参与了HCC 的恶性进展，两者联合AFP 对HCC 有较高的诊断价值。然而本研究选取的病例数较少，且仅设计了健康对照组，未纳入单纯肝硬化、病毒性肝炎、脂肪肝等良性肝脏疾病人群，这些不足之处将在后续的研究中加以完善。