具有优良发酵特性德氏乳杆菌保加利亚亚种的筛选及其益生特性

王磊，高宗露，宗丽娜，吕田，鲁茂林，王文琼，陈大卫，徐粉林，顾瑞霞

（1.扬州大学江苏省乳品生物技术与安全控制重点实验室，江苏扬州 225127）（2.维维食品饮料股份有限公司，江苏徐州 221000）

乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）是指一类可以利用碳水化合物发酵产生乳酸的细菌，被认为是安全（Generally Regarded as Safe，GRAS）的益生菌，在益生菌中占有重要地位[1]。欧美等一些发达国家较早对乳酸菌进行了研究，这些国家不但成立了自己的乳酸菌菌种资源库，而且研发出了拥有自主知识产权的优势乳酸菌及其发酵制剂[2]。由于我国对乳酸菌的研究工作起步较晚，只有很少的具有自主知识产权的乳酸菌及其发酵剂[3]。目前，国内学者已扩大了对乳酸菌资源的研究，并且筛选出了一些优良的乳酸菌，这大大加快了我国乳制品行业的发展。

德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus）简称保加利亚乳杆菌，是乳杆菌属的模式种[4]，在发酵过程中可经同型乳酸发酵将乳糖转化为乳酸[5]，并且将蛋白质降解为肽类和氨基酸[6]，为乳制品提供了独特的质地、风味[7]，同时赋予乳制品特殊的食疗功效[8]，也提高了乳制品功能特性以及营养价值[9,10]。

德氏乳杆菌保加利亚亚种是工业生产发酵乳制品最主要的酸乳发酵剂菌种之一[11]，筛选出具有优良发酵性能的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株具有潜在的经济价值，对乳酸菌资源的开发利用具有重要的战略意义。本研究旨在通过对传统发酵制品中分离出的德氏乳杆菌保加利亚亚种的发酵和益生特性进行研究，以期筛选出具有优良发酵特性的乳酸菌菌株，为国内酸乳发酵剂生产提供指导和菌种资源，

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 试验材料

试验菌株：10株德氏乳杆菌保加利亚亚种（分离自传统发酵乳制品，由扬州大学乳品生物技术与工程江苏省重点实验室提供）。

病原指示菌：大肠杆菌（Escherichia coliCICC10012）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureusCICC10201）、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilisCICC10012)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereusCICC102311)、肠伤寒沙门氏菌(Salmonella enterotyphiWX29)、布氏假单胞菌(Pseudomonas brenneriCICC1027)，购自中国工业微生物菌种保存管理中心。

全脂乳粉、脱脂乳粉，新西兰乳业有限公司；白砂糖，超市购买；β-半乳糖苷酶（β-Gal）活性检测试剂盒、α-半乳糖苷酶（α-Gal）活性检测试剂盒，北京索莱宝科技有限公司；乳酸脱氢酶（LDH）活性检测试剂盒、蛋白定量检测试剂盒，南京建成生物工程研究所；药敏试纸，杭州天和微生物试剂有限公司。

1.1.2 试验设备

蒸汽灭菌锅SX-500，日本TOMYG公司；超净工作台SW-CJ-1F，苏州净化设备有限公司；高压均质机GYB60-08，上海东华高压均质机厂；电子天平PL2002，梅特勒公司；恒温水浴锅HH6，国华电器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株的活化及全脂乳的制备

1.2.1.1 菌株活化及菌悬液的制备

将菌种保藏管中的德氏乳杆菌保加利亚亚种接种于MRS液体培养基中，转接活化2次后，按3%的接种量接种于12%的脱脂乳培养基中。待凝乳后，置于4 ℃冰箱冷藏备用。

1.2.1.2 全脂乳的制备

将蒸馏水预热至50 ℃，加入12%全脂乳粉混匀，待温度上升至60 ℃时，加入质量分数为6.5%的蔗糖溶解搅拌，使其充分混合，经过均质（20 MPa，循环2次）处理，接着将均质好的全脂乳分装于500 mL蓝盖瓶中，95 ℃杀菌15 min，最后将全脂乳急冷于4 ℃冷藏备用。

1.2.2 样品的制备

将供试菌株照1.2.1.1的方法的得到脱脂乳培养基，按照2%的接种量接种于全脂乳培养基中，37 ℃水浴10 min后，立即置于37 ℃培养箱中恒温发酵，观察其凝乳情况，并对菌株发酵过程及贮藏期间各时间点（贮藏0 d、1 d、7 d、14 d）取样，用于后续各项发酵特性指标的测定。

1.2.3 凝乳时间的测定

表1 抗生素耐药性的判断标准Table 1 Criteria for judging antibiotic resistance

将活化好的菌株以2%的接菌量接种到全脂乳培养基中，于37 ℃条件下恒温发酵,记录菌株发酵全脂乳至凝乳的时间。

1.2.4 滴定酸度的测定

称取5.00 g左右酸乳样品，记录质量m，用40.00 mL蒸馏水稀释，并加酚酞指示剂，用0.1 mol/L的NaOH滴定至微红色，并在30 s内不变色，记录体积V，计算样品酸度。

1.2.5 pH的测定

用pH计测定发酵乳的pH值。

1.2.6 黏度的测定

终止发酵，调整温度至4 ℃，采用PV-2黏度仪测定发酵乳样品的黏度（4号转子，30 r/min），稳定后读取数值。

1.2.7 持水力的测定

在发酵及贮藏期间各时间点，准确称取10 g发酵乳样品，于4 ℃离心10 min，转速为4500 r/min，倾去上清液后将离心管倒置。

1.2.8 乳酸菌产香能力的测定

1.2.8.1 双乙酰含量测定

参考蔡晶晶等人方法测定[12]。按照参考的测定方法绘制双乙酰标准曲线。然后取待测乳样品，用16%三氯乙酸溶液等体积与其混合，混匀后静置10 min，5500 r/min离心10 min后取上清液。取上清液10 mL，等体积加入2个试管中，向1号试管中加入1%的邻苯二胺溶液0.25 mL，2号试管不加，充分混匀后于黑暗处使其反应30 min，然后向2个试管中加入4.0 mol/L的盐酸进行终止反应（1号试管加1.0 mL，2号试管加1.25 mL），混匀后以2号试管作为对照液，在335 nm波长测定吸光值。

1.2.8.2 乙醛含量测定

参考任然等人方法测定[4]。取1% NaHSO3溶液2 mL置于三角锥形瓶中，加入处理后试样上清液10 mL，混匀后在室温下放置1 h，然后加入1%淀粉溶液1 mL，用0.1 mol/L碘液滴定至接近淡蓝紫色，再用0.01 mol/L碘液滴定至淡蓝紫色，并且在30 s内淡蓝紫色不褪去，以上的滴定均不计数。然后加入20 mL 1 mol/L的NaHCO3，充分振荡混匀，使溶液蓝紫色消失，最后用0.01 mol/L碘液滴定至蓝紫色终点，记录消耗标准碘液的体积，每个样品有两个平行，并同时做空白试验。

其中：M：乙醛含量，mg/L；V1：滴定样品消耗碘标准溶液体积，mL；V2：滴定空白消耗碘标准溶液体积，mL；C：碘标准溶液的浓度，mol/L；10：样品称样量，mL；0.022：乙醛反应化学基本单位，g。

1.2.9 抗生素耐药性的测定

表1为抗生素耐药性的判断标准。利用药敏纸片琼脂扩散法（K-B法）对分离的乳酸菌进行青霉素、头孢唑啉、头孢唑啉(先锋)、氯霉素、万古霉素、四环素、复方新诺明、氨苄西林、克拉霉素、链霉素、环丙沙星和利福平12种抗生素的耐药性敏感试验。将待测菌株活化二代，将菌液10000 r/min 4 ℃，离心5 min，并以无菌生理盐水调整菌液浓度至OD600=0.5，取菌液200 μL涂布，待培养基上的菌液略干后，以无菌操作取出药敏纸片，贴于接好同种乳酸菌诱导的LB固体平板内，同时设空白药敏纸片为对照。然后置于37 ℃培养箱培养24 h，测量并记录抑菌圈直径。根据美国临床和试验室标准化研究所制定的《抗菌药物敏感性试验执行标准》（2017年版）评价试验乳酸菌对抗生素的耐药性。

1.2.10 抑菌能力的测定

将致病菌活化2代，以生理盐水调整菌液浓度至OD600=0.5，冷藏备用，无菌操作下，将灭菌LB培养基倾倒至平板，冷却至培养基完全凝固，后将活化好的二代致病菌稀释100倍，分别取稀释完成的蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、假单胞菌、沙门氏菌及大肠杆菌100 μL注于完全凝固平板上，用涂布棒涂抹均匀，用打孔器在每个平板上均匀打孔，吸取供试菌株发酵液200 μL加入小孔中，将加样平板正置于18 ℃培养箱扩散12 h，移至37 ℃培养箱培养12 h，测量并记录抑菌圈直径。

1.2.11 酶活能力的测定

1.2.1 1.1 粗酶液的制备

取10.00 mL发酵液于4 ℃条件下，采用8000 r/min离心2 min，收集菌体。用pH 7.0的磷酸盐缓冲液洗涤菌体2次，最后加入10.00 mL缓冲液，反复吹打使其重悬。冰浴中用超声破碎仪破壁制备粗酶液，超声脉冲功率为25 W，脉冲持续时间5 s，间隙5 s，破壁10 min。离心除去细胞碎片，所得上清液为粗酶液。

1.2.1 1.2β-半乳糖苷酶（β-Gal）活性测定

β-半乳糖苷酶活性测定按试剂盒说明书方法测定。

1.2.1 1.3 乳酸脱氢酶（LDH）活性测定

乳酸脱氢酶（LDH）活性测定按试剂盒说明书方法测定。

1.2.12 数据分析

其次，优化数学史渗透方法。数学教师在数学课堂中渗透数学史时，要注意方法的选择，从而提升渗透效果。比如，教师可以引导学生阅读一些有关数学史的读物，这有利于学生全面的掌握数学史的有关内容并让其感受到数学史的博大精深；此外，教师还可以根据学生的兴趣爱好，运用学生喜欢的教学方式。比如在对数学家华罗庚进行说明时，可以选它的画像、故事、传记以及他的名言“聪明在于学习，天才在于积累”等内容来有机渗透教学，丰富学生学习数学的情感，激发学生热爱数学史的思想情操。

所有试验重复测定三次，各项指标的数据均用Origin 2018软件处理作图，并采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。测量数据均以Mean±S.D表示，p＜0.05认为有显著差异。

2 结果与分析

2.1 单菌株发酵特性的研究

2.1.1 单菌株产酸曲线的测定

图1为单菌株发酵酸乳的产酸曲线。产酸曲线表明菌株的产酸速度和产酸量。产酸快慢决定着发酵周期的长短，产酸能力反应菌株的发酵活力[13]。供试菌株发酵过程中，0～2 h内pH值和酸度变化缓慢，2～16 h内快速下降，16 h后趋于稳定。由图1b可知不同供试菌株发酵酸乳产酸速率有所不同，其中菌株KSDB-1、HDS-12、DDB-14、HDS-18发酵48 h后酸度可达到200 °T以上，具有较好的产酸能力。

图1 单菌株发酵酸乳的产酸曲线Fig.1 Acid production curve of yoghurt fermented by single strain

2.1.2 单菌株发酵性能测试

表2 不同德氏乳杆菌保加利亚亚种发酵性能初筛Table 2 Number and fermentation time of different Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus strains

不同德氏乳杆菌保加利亚亚种的发酵时间由表2所示，发酵时间是衡量乳酸菌发酵性能的重要指标，发酵时间过长会增加其他微生物的感染率。在实际生产过程中，发酵时间过长还会增加生产成本、降低生产效率，严重影响企业的经济效益。10株供试菌株发酵酸乳的发酵时间在5～12.5 h之间，其中发酵时间低于8 h的菌株有8株；滴定酸度在59.65 °T～77.76 °T之间，其中菌株KSDB-1的滴定酸度最高达到了77.76 °T，显著高于其他供试菌株（p＜0.05），具有较好的产酸能力。

2.1.3 单菌株产香性能测试

不同德氏乳杆菌保加利亚亚种发酵酸乳产香能力如图2所示。乙醛和双乙酰是构成酸乳典型风味的重要化合物，其含量以及两者之间的比例会对酸乳的风味产生较大的影响。一般认为当酸奶中乙醛含量在23 mg/L～40 mg/L时，才能产生具有良好风味的酸乳[14]。研究表明乙醛与双乙酰的含量比值大于3:1时，酸乳的风味最佳[15]。10株供试菌株乙醛和双乙酰含量比值均大于3:1。菌株HDS-13、DDB14、KSDB-1具有较好的产香能力较好，其中菌株HDS-13的双乙酰含量为2.88 mg/L，乙醛含量达到了30.08 mg/L，能显著改善酸乳的风味。

图2 不同德氏乳杆菌保加利亚亚种产香性能测试Fig.2 Aroma production performance test of different Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus strains

2.2 酸乳的贮藏稳定性

表3 不同德氏乳杆菌保加利亚亚种发酵酸乳贮藏期间酸度的变化（°T）Table 3 Changes in titration acidity during storage of fermented yoghurt by Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus strains (°T)

表4 不同德氏乳杆菌保加利亚亚种发酵酸乳贮藏期间黏度的变化（mPa·s）Table 4 Changes in viscosity during storage of fermented yoghurt by Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus strains (mPa.s)

2.2.1 单菌株发酵酸乳贮藏期间酸度的变化

不同供试菌株发酵酸乳样品4 ℃贮藏期间酸度值的变化如表3所示，10株供试菌株发酵酸乳贮藏1 d时酸度在46.65 °T～82.76 °T之间，其中菌株KSDB-1和菌株HDS-13发酵的酸乳酸度显著高于其他供试菌株（p＜0.05），分别为82.76 °T和70.14 °T。乳酸菌后酸化是导致酸乳贮藏期品质变化主要原因之一，其中德氏乳杆菌保加利亚亚种是导致发酵乳发生后酸化的主要菌株[16]。10株供试菌株发酵酸乳表现出不同程度的后酸化程度，其中菌株DDB-14和菌株HDB-17发酵的酸乳贮藏1～14 d后后酸化程度显著高于其他菌株（p＜0.05）其余菌株后酸化能力相对弱，符合优良乳酸菌发酵剂具有的特点。

不同供试菌株发酵酸乳样品4 ℃贮藏期间黏度值的变化如表4所示，黏度是评定酸乳质量的重要指标之一，选择产黏性好的菌株能够改善发酵乳的组织状态，但是黏度较大对工业化生产不利[17]。10株供试菌株发酵完成后黏度值在215 mPa·s到1395.67 mPa·s之间，其中菌株DDB-14和菌株KSDB-1具有较好的产黏能力，发酵完成时的黏度分别在1031.67 mPa·s和1305.67 mPa·s，显著高于其它菌株（p＜0.05）。大多数菌株贮藏1 d，黏度达到峰值，贮藏7 d后黏度值开始出现小幅度下降。

2.2.3 单菌株发酵酸乳贮藏期间持水力的变化

不同供试菌株发酵酸乳样品4 ℃贮藏期间持水力的变化如表5所示，持水力的强弱直接影响着发酵乳乳清的析出程度[18]。10株供试菌株发酵酸乳的持水力在35%～50%之间，贮藏1 d持水力达到峰值，贮藏14 d后出现不同程度的下降，这可能是因为贮藏期间发酵乳酸度的变化，造成发酵乳组织结果发生变化从而导致持水力的变化[19]。菌株DDB-14、HDB-17和KSDB-1贮藏1 d后持水力分别54.83%、50.82%和56.55%，其贮藏7 d后差异不显著（p＜0.05），说明这些菌株发酵乳样品贮藏期间能保持良好的组织稳定性。

表5 不同德氏乳杆菌保加利亚亚种发酵酸乳贮藏期间持水力的变化（%）Table 5 Changes in water-holding capacity during storage of fermented yoghurt by Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus strains(%)

表6 不同德氏乳杆菌保加利亚亚种对12种抗生素耐药性的结果Table 6 Results of resistance of different Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricusto 12 antibiotics

表7 不同德氏乳杆菌保加利亚亚种发酵上清液中抑菌能力的测定Table 7 Determination of bacteriostatic capacity in fermentation supernatants of different Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus

2.3 乳酸菌抗生素耐药性测定

不同德氏乳杆菌保加利亚亚种的抗生素耐药性结果如表6所示，乳酸菌的食用历史长达数千年，是世界公认的 “ GRAS ” 的微生物[20]。但近年来，越来越多的研究表明，对人和动物体内具有特殊生理功能有益菌群的乳酸菌也产生了耐药性[21]。10株供试菌株对头孢唑啉、氯霉素、万古霉素、四环素、克拉霉素、利福平均敏感，对青霉素、头孢唑啉先锋、氨苄西林普遍敏感，对复方新诺明、链霉素和环丙沙星耐药率较高。综合可知，10株供试菌株可以认为是比较安全的，可以作为有益的菌株进一步应用于食品工业中。

2.4 乳酸菌培养上清液抑菌能力测定

不同德氏乳杆菌保加利亚亚种发酵上清液中抑菌能力如表7所示。在发酵过程中，乳酸菌能够将糖转化为乳酸，并且有些能够产生抗菌活性代谢物，如过氧化氢、细菌素等，从而抑制腐败菌及食源性致病菌的繁殖[22]。10株供试菌株普遍对6种致病菌呈现不同程度的抑制能力，其中菌株HDS-13、DDB-14、HDB-1、HDS-18、KSDB-1对6种致病菌抑制能力显著高于其他菌株（p＜0.05），说明这些供试菌株对细菌具有广谱抑菌特性，能有效抑制肠道致病菌的生长。

2.5 相关酶活能力测定

不同德氏乳杆菌保加利亚亚种相关酶活能力如图3所示。乳酸脱氢酶是糖代谢途径中的关键酶，可以催化丙酮酸与乳酸之间的可逆反应，其活性大小与微生物的产酸能力有关[3]。由图3a可知，10株供试乳酸脱氢酶酶活在0.12855～0.3586 U/mg之间，其中菌株HDS-12和KSDB-1乳酸脱氢酶活力显著高于其他菌株（p＜0.05），分别为0.3586 U/mg和0.3473 U/mg。

图3 不同德氏乳杆菌保加利亚亚种相关酶活能力的测定Fig.3 Determination of related enzyme activity of different Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus

β-半乳糖苷酶能水解乳糖为葡萄糖和半乳糖,生产低乳糖食品,以缓解乳糖不耐症，同时又具有转半乳糖基活性,可用于低聚半乳糖的合成[23]。由图3b可知，10株供试菌株β-半乳糖苷酶酶活在0.1320～0.7093 U/mg之间。其中菌株HDS-12，HDB-17β-半乳糖苷酶活力显著高于其他菌株（p＜0.05），分别为0.6967 U/mg和0.7093 U/mg。

α-半乳糖苷酶又称蜜二糖酶，属于外切糖苷酶类，水解酶的一种，该酶在食品工业、轻化工领域有较高的应用价值，被认为是最有应用潜力的酶制剂之一，可用于生产能够促进肠道益生菌增值的益生元α-低聚半乳糖[24]。由图3b可知，10株供试α-半乳糖苷酶酶活在0.1113～1.3263 U/mg之间，其中菌株DDS-15β-半乳糖苷酶活力显著高于其他菌株（p＜0.05），为1.3263 U/mg，未来可对其进一步研究。

3 结论

本文通过单菌株发酵特性和益生特性实验对实验室保存的10株德氏乳杆菌保加利亚亚种进行了分析研究，并筛选出性能较好的菌株KSDB-1。菌株KSDB-1凝乳时间为6.3 h，凝乳酸度为76.02 °T，表现出较好的产酸能力，同时黏度和持水力分别为1305.67 mPa·s和50.55%，表现出较好的产黏能力和组织稳定性，贮藏15 d内后酸化程度较弱，各指标相对稳定，且具有良好的产香能力，对大部分抗生素表现为敏感，具有较高的安全性，能有效抑制肠道致病菌的生长，乳酸脱氢酶活力较高，适合对其培养基和高密度发酵工艺进行进一步优化，以期将其应用于工业化生产中。