机械化酱香型轮次基酒风味结构及特征酯类化合物解析

何东梅，马 宇 ，黄永光,*，尤小龙，程平言，胡 峰

（1.贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州省发酵工程与生物制药重点实验室，贵州 贵阳 550025；2.贵州茅台酒厂（集团）习酒有限责任公司，贵州 习水 564622）

酱香型白酒是中国四大基本香型白酒之一[1]，其具有酱香突出，幽雅细腻，酒体醇厚，回味悠长，空杯留香的独特酒体风格，赢得了国内外消费者的喜爱[2]。目前，酱香型白酒正处于快速发展阶段，其市场占比逐年上升[3]，将为酿酒行业经济发展作出更大的贡献。

风味是酒类产品质量的重要评价指标，亦是消费者对产品选择的主要影响因素，我国白酒风味物质研究始于1964年茅台酒的第2次试点[4]。近年，风味化学技术在清、浓、酱、芝麻等香型白酒风味物质研究中得到广泛应用，并形成了系统的酒体风味分析研究技术体系[5]，其中，通过分析香气物质在白酒中的浓度与该香气物质的阈值浓度的比值，香气活性值（odor activity values，OAV）判断香气物质对酒体的风味贡献，即OAV越大，说明该香气化合物越重要[6]，从而筛选出重要的风味化合物，结合该化合物的气味描述，即可得出该化合物对酒体所贡献的具体风味。到目前为止，酱香型白酒的主体香气成分还未获得定论，其风味机制一直受到科研工作者的深切关注。如Yan Yan等[7]建立基于顶空固相微萃取结合二维气相色谱-飞行时间质谱的分析方法，在酱香型白酒及其轮次基酒中定性定量出19 种挥发性硫化合物，报道了甲基糠基二硫醚等7 种对轮次酒有重要香气贡献的挥发性硫化物；Zhao Tengfei等[8]在酱香型白酒中发现一种后鼻嗅糊味化合物，为研究酱香型白酒主体香气成分提供了新导向。

机械化酿造是传统白酒转型升级发展的必然，相比传统酿造具有可控性强，产品质量更稳定、更节约资源、生产效率高等优势。酱香型白酒将不断由传统生产模式向机械化、自动化生产发展，针对酱香型白酒机械化酿造的研究也随之展开，如郭敏[9]利用高通量测序系统对贵州XJ公司机械化和传统酱香大曲制曲过程的微生物菌群结构多样性及其重要微生物变化规律进行了研究，发现传统和机械化制曲在微生物层面，特别是主要菌群结构方面没有明显差异；席德州[10]利用高通量测序结合可培养方法，系统研究酱香型白酒机械化酿造过程的微生物群落结构，发现机械化酿造与传统酿造的主要细菌属和真菌属在丰度上存在较大的相似性；王欢等[11]对酱香型白酒机械化酿造不同轮次堆积发酵细菌菌群结构进行了多样性分析，结果表明各轮次的酿酒微生物稳定性较好，酿造过程存在固有的特征性菌群结构。前述的大量研究工作对于认识酱香型白酒作出了重要贡献，为明晰酱香白酒中主要风味成分及其风味机制具有积极意义，为推动酱香型白酒科学酿造、健康发展作出了重要贡献。优质的基酒是高品质产品的必要条件，现有大部分研究工作均是围绕酱香成品酒展开的，其轮次基酒的系统化研究屈指可数，且目前暂无对酱香型机械化酿造轮次基酒风味结构特征及其风味机制的相关报道。

为了充分认识机械化酱香型白酒轮次基酒的风味结构特征，本研究以贵州XJ公司机械化酿造酱香型白酒轮次基酒为研究对象，应用风味组学技术对其进行系统解析，揭示轮次基酒的风味结构及其特征酯类化合物。旨在为推进机械化酿造酱香型白酒发展提供基础理论和学科依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

贵州XJ公司机械化生产车间2017年四车间生产的3 个平行窖池产出的轮次基酒综合样，每个轮次酒样1 000 mL，分别为1轮次（J1，乙醇体积分数60.90%）、2轮次（J2，乙醇体积分数57.10%）、3轮次（J3，乙醇体积分数55.35%）、4轮次（J4，乙醇体积分数55.15%）、5轮次（J5，乙醇体积分数55.00%）、6轮次（J6，乙醇体积分数54.35%）、7轮次（J7，乙醇体积分数54.05%）。

无水乙醇、2-辛醇（均为色谱纯），正构烷烃混合标准品（C7～C40） 美国Sigma-Aldrich公司；乙酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、己酸丙酯、庚酸乙酯、乙酸异戊酯、辛酸乙酯、壬酸乙酯、癸酸乙酯、丁二酸二乙酯、十二烷酸乙酯、十四烷酸乙酯、十五烷酸乙酯、十六烷酸乙酯、油酸乙酯、亚油酸乙酯、2-丁醇、1-丙醇、2-甲基-1-丙醇、1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇、1-戊醇、2,3-丁二醇、丙二醇、1-己醇、1-辛醇、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、苯丙酸乙酯、苯甲醛、苯乙醇、糠醛、2-乙酰基-5-甲基呋喃、2-甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、三甲基吡嗪、四甲基吡嗪、乙醛、乙缩醛、乙偶姻、苯酚、4-乙基苯酚、对甲酚（均为色谱纯），无水乙醚、氯化钠、无水硫酸钠、浓硫酸、碳酸氢钠（均为分析纯） 上海国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

GC 7890-5975 MSD GC-MS联用仪、DB-FFAP毛细管色谱柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm） 美国Agilent公司；MPS2型多功能自动进样系统 德国Gerstel公司；超声波清洗仪 上海超声仪器厂；Aquaplore3S超纯水系统 美国艾科浦公司；OA-SYS型氮吹仪上海安谱科学仪器公司。

1.3 方法

1.3.1 液液萃取

参考Fan Wenlai等[12]的方法，用超纯水将150 mL酒样稀释至乙醇体积分数为13%，加100 μL内标（2-辛醇，终质量浓度1.065 mg/L），摇匀后加入氯化钠饱和（氯化钠的质量分数约为30%）。用1∶4盐酸溶液调pH值至2，用60 mL乙醚分3 次萃取，静置分层后合并有机相得到酸性组分。水相用10%氢氧化钠溶液调pH值至12，用60 mL乙醚分3 次萃取，静置分层后合并有机相得碱性组分。调余下水相pH值至7，用60 mL乙醚分3 次提取，合并萃取液得到中性组分。分别添加过量无水硫酸钠至3 个组分中，并置于-20 ℃过夜干燥，氮吹浓缩至1.5 mL，最终进样量为1.0 μL，待下一步检测分析。平行实验3 次。

1.3.2 风味化合物定性定量

1.3.2.1 检测条件

气相色谱条件：DB-FFAP毛细管色谱柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；进样口温度250 ℃；不分流进样；氦气作为载气（流速2.0 mL/min）；程序升温：色谱柱初温40 ℃，维持2 min，以2 ℃/min升温到100 ℃，再以4 ℃/min升温至220 ℃，保持5 min。

质谱条件：电子电离源：离子源温度230 ℃；电子能量70 eV；质量扫描范围m/z35～350。

1.3.2.2 定性分析

利用NIST 11a. L谱库检索并结合保留指数（retention index，RI）对未知化合物定性，其中RI的计算方法参照改进后的Kovats方法[13]计算。

1.3.2.3 定量分析

有标样的化合物用外标法定量，无标样的化合物采用内标法定量。

标准曲线法定量：以体积分数10%乙醇溶液为溶剂配制具有一定浓度的待测物标准液，并进行梯度稀释。分析条件与酒样的分析条件相同。采用选择离子法计算各化合物的峰面积，以化合物与内标物的峰面积比为横坐标，质量浓度之比为纵坐标，建立标准曲线。将色谱峰信噪比大于3的质量浓度确定为检出限，信噪比大于10确定为定量限，进行全定量分析。

内标法定量：通过计算内标物的峰面积和样品中各组分的峰面积比值，从而定量出各个风味成分的含量，每组样品测定3 次取平均值。

1.3.2.4 关键香气活性物质分析

参考文献[14]计算香气化合物的OAV，即风味化合物在样品中的浓度与该化合物的嗅觉阈值之比。一般认为，OAV＞1，表明该物质对总体香气有直接贡献；OAV＜1，表明该物质对总体香气无实质性贡献，通常情况下，OAV越大则说明该物质对总体香气的贡献越大。

1.4 数据处理

采用Microsoft Office Excel 2010对数据进行计算，R语言、TBtools、Origin绘制相关图形。

2 结果与分析

2.1 轮次基酒挥发性风味化合物结构特征

根据前述方法对样品酒中风味化合物进行提取、分离，经对图谱进行解析汇总，在机械化酿造酱香酒1～7 个轮次基酒中共定性定量检测出乳酸乙酯、糠醛、异戊醇等266 种化合物，其中酯类92 种，醇类51 种，酸类36 种，醛酮类28 种，含氮化合物类（主要是吡嗪类）22 种，芳香族类12 种，烃类12 种，呋喃类3 种，醚类5 种，其他类（主要是糖类）5 种。将检出各类化合物种类数及含量作堆叠柱形图，如图1所示。

如图1所示，2、4、5轮次所含风味化合物的种类最多，1、3轮次较多，6、7轮次相比之下所含种类较少。除7轮次外，各轮次均是酯类化合物的种类最多，占据主导性地位。机械化酿造酱香轮次基酒风味化合物的结构总体上以酯类、醇类、酸类为主，与传统生产方式一致[15]。1、2轮次中酯类含量占比最大（J1：50.08%，J2：48.42%），醇类（J1：19.31%，J2：24.42%）和酸类（J1：17.69%，J2：18.51%）为其次，相差不大；3、4、5轮次中酯类含量占比（J3：42.09%，J4：37.32%，J5：35.94%）仍为最大，醇类（J3：31.33%，J4：36.12%，J5：36.50%）为其次，酸类（J3：16.18%，J4：18.37%，J5：21.17%）第三；6、7轮次中酯类（J6：15.73%，J7：25.70%）、醇类（J6：31.21%，J7：56.05%）、酸类（J6：42.53%，J7：0.63%）含量占比均相差很大。从图1还可看出，1～7轮次基酒检出的主要挥发性风味化合物结构存在明显差异，风味化合物的种类及含量呈先上升后下降再上升再下降的趋势。王晓欣[15]在分析酱香白酒传统酿造轮次酒中风味物质时，风味化合物总量最高的轮次是1轮次，而在机械化酿造轮次基酒中，主要风味化合物的种类及含量最多的是2轮次，轮次酒中风味物质主要来源于原料及酿造过程中微生物的代谢，这表明传统酿造和机械化酿造之间，原料的糖化及微生物的代谢活动上存在一定的差异。刘民万等[16]用顶空-固相微萃取-气相色谱-质谱对酱香型白酒传统酿造不同轮次堆积酒醅进行分析，发现3、4、5轮次堆积酒醅中醇、酸、酯达到相对平衡，与最终蒸馏所得酱香型白酒品质有一定关联，3、4、5轮次酒称为“大回酒”，酒质最好，占总产量的55%以上[17]；在本研究中，3、4、5轮次基酒中酯、醇、酸结构相对平衡，酒中风味物质主要来源于发酵酒醅的蒸馏，说明传统与机械酿造酒中各类微量化合物的相对配比具有相似性。

图1 1～7轮次基酒主要风味结构图Fig.1 Flavor composition of base liquors from the first to seventh fermentation round

为了继续探究轮次基酒间主要风味化合物结构的相似及差异，利用Upset Plot将1～7轮次中风味物质的重叠情况进行可视化，如图2所示。由图2可知，在检出的266 种主要风味化合物中，1～7轮次间共同存在丙醇、异丁醇等30 种化合物，其中醇类有11 种，酯类7 种，酸1 种，醛酮类2 种，含氮类5 种，呋喃类2 种，醚类及酚类各1 种。将这类在1～7轮次中共同存在的物质称为轮次酒的“骨架成分”，将仅在某1轮次存在的物质称为该轮次的“特征性成分”。1～7轮次间明显不同的风味特征由其“骨架成分”及各轮次所特有的“特征性成分”构成，不同轮次中“骨架成分”的质量浓度配比不同，“特征性成分”也不同。在本研究中，J2中的“特征性成分”最多，有43 种，其余轮次有8～10 种。吕佳慧等[18]采用顶空-固相微萃取-气相色谱-质谱技术发现相比粳高粱，糯高粱水解后香气化合物总量更高，含量差异较大的是醛酮类，糯高粱比粳高粱高6.21%，而酱香型白酒的生产原料正是糯高粱，在2轮次酒的发酵过程中，粮谷中的糖类、蛋白类等微生物可利用的基质十分丰富，由此，产出的风味物质种类及含量最高，其中醛酮类也为各轮次中含量最高。仅1、2轮次共同检出的主要物质有乳酸丁酯、苯酚等9 种，仅3、4、5轮次中共同检出的主要物质有正辛醇、戊酸乙酯等4 种，仅在1～5轮次中检出的主要物质有乳酸异丁酯、DL-白氨酸乙酯等6 种，这些物质是造成1、2轮次基酒中粮香、花果香突出而稍偏清香，3、4、5轮次基酒香气协调，6、7轮次基酒偏糊偏苦的因素之一。

图2 机械化酱香型1～7轮次基酒中主要风味物质Venn图Fig.2 Venn diagram showing unique and shared major flavor substances between mechanized sauce-flavor Baijiu base liquors from the first to seventh fermentation round

综上可知，酱香白酒的传统酿造与机械化酿造轮次基酒间风味结构具有较好的相似性；同时，各轮次间的风味结构差异也较明显，在酯、醇、酸、醛酮4 类风味物质中尤为突出，酯类物质是酱香型轮次基酒风味结构中最重要的风味化合物。基于此，本研究继续着重对机械化酿造轮次基酒中酯类物质及其风味贡献进行分析。

2.2 机械化轮次基酒中酯类化合物

中国白酒最大的香气特征是以“酯香”为主[19]，目前在白酒中已报道的酯类物质有506 种[20]，酯类物质是目前白酒质量鉴定的重要指标。本研究从机械化酿造的酱香型轮次基酒中共检测出92 种酯类化合物，占所检出主要挥发性化合物种类的34.59%，各轮次中检出的主要酯类化合物结构存在较大差异。相比于Fan Wenlai等[21]从14 个传统酱香型白酒成品酒中定性定量了25 种酯，王晓欣[15]在传统酱香基酒中定量出28 种酯类来讲，本研究定量出的主要酯类化合物较多。目前，认为酯类的形成途径主要有3 种[22]：一是由相关微生物在酰基辅酶A合成酶和醇乙酰转移酶的作用下进行生物合成[23]，二是在酒曲酯化酶及脂肪酶的作用下催化醇和酸反应而成[24]，三是通过有机化学反应生成[25]。根据各轮次基酒中检出的酯类物质含量作气泡图（图3），更能直观地呈现样品中酯类化合物含量及不同酯类化合物在1～7轮次基酒中含量的变化规律。

图3 机械化酱香型1～7轮次基酒中酯类化合物含量气泡图Fig.3 Bubble chart of ester contents in mechanized sauce-flavor Baijiu base liquors from the first to seventh fermentation round

在92 种酯类化合物中，1轮次中检出32 种，共1 447.07 mg/L；2轮次中检出52 种，共3 062.85 mg/L；3轮次中检出33 种，共751.42 mg/L；4轮次中检出39 种，共894.91 mg/L；5轮次中检出45 种，共1 479.53 mg/L；6轮次中检出24 种，共308.38 mg/L；7轮次中检出15 种，共119.19 mg/L。整体变化为1、2轮次先升高后3轮次下降，4、5轮次升高后6、7轮次又下降至最低。由图3可知，L(-)-乳酸乙酯、十六酸乙酯、油酸乙酯、9,12-十八碳二烯酸乙酯、十四酸乙酯、9-十六碳烯酸乙酯、硬脂酸乙酯、13-甲基十四酸乙酯在1～7轮次中均有检出，文献[26]表明，乳酸乙酯、乙酸乙酯是我国白酒的主体酯类，酱香型酒中还有一定量的己酸乙酯；在本研究中，因液液萃取方法对其有较大损失，该3 种酯的检出量均较低，对该类高浓度化合物，应选择气相色谱-火焰离子检测器对其进行定性定量较为准确。基于前人大量的研究工作以及本研究中前处理方法的局限性，本研究认为该3 种酯类物质是机械化酱香型轮次基酒的主要成分。综上表明，乳酸乙酯、乙酸乙酯、己酸乙酯、十六酸乙酯、油酸乙酯、9,12-十八碳二烯酸乙酯、十四酸乙酯、9-十六碳烯酸乙酯、硬脂酸乙酯、13-甲基十四酸乙酯10 种酯类是轮次酒中的“骨架酯”。杨萍等[27]从传统酒曲及窖内酒醅中检出乳酸乙酯、十六酸乙酯（棕榈酸乙酯）、油酸乙酯等，韩兴林等[28]利用顶空-固相微萃取-气相色谱-质谱从传统酿造酱香白酒堆积发酵过程中检出乳酸乙酯，黄永光等[29]对传统堆积发酵过程中酒醅进行分离，并对其中优势菌株的发酵代谢物检测分析，结果表明棕榈酸乙酯等的含量较高，说明棕榈酸乙酯、乳酸乙酯、油酸乙酯等化合物在传统酱香基酒的酿造过程中具有广泛来源，而在机械化酿造轮次基酒中同样检出该类酯类化合物，由此说明酱香白酒传统及机械化酿造的基酒间具有相似的“骨架酯”，从酯类风味化合物层面表征了机械化酿造与传统酿造具有较好相似性。

在J1、J2中均存在仅在该轮次含量较高的物质，分别为J1乳酸异戊酯，J2亚麻酸乙酯、甲氧基乙酸3-甲基丁酯。这些酯类化合物可定性为是对应轮次的“酯类标志成分”，有助于快速识别轮次基酒以及为规范生产提供科学依据。

综上可知，乳酸乙酯、乙酸乙酯、己酸乙酯、十六酸乙酯、油酸乙酯、9,12-十八碳二烯酸乙酯、十四酸乙酯、9-十六碳烯酸乙酯、硬脂酸乙酯、13-甲基十四酸乙酯10 种酯类是轮次酒中的“骨架酯”。2 个轮次中存在特征突出的“酯类标志成分”，分别为J1乳酸异戊酯、J2亚麻酸乙酯和甲氧基乙酸3-甲基丁酯。

2.3 机械化轮次基酒特征酯类香气化合物

为了进一步揭示机械化酿造轮次基酒中酯类化合物对各轮次基酒的风味贡献，通过将计算所得酯类化合物的OAV作热力图，酯类风味物质对轮次基酒的风味贡献在图4中得到有效可视化。机械化酱香型轮次基酒中主要酯类物质香气描述语及其阈值见表1。

图4 机械化酿造酱香型轮次基酒（J1～J7）中酯类风味化合物OAV热力图Fig.4 Heat map of OAV of ester aroma compounds in mechanized sauce-flavor Baijiu base liquors from the first to seventh fermentation round

表1 机械化酱香型轮次基酒中主要酯类物质香气描述及其阈值Table 1 Aroma descriptors and thresholds of major esters in mechanized sauce-flavor Baijiu base liquors from the first to seventh fermentation round

由图4可知，己酸乙酯（甜香，水果香，窖香，青瓜香）、苯乙酸乙酯（玫瑰，蜂蜜）、乙酸苯乙酯（玫瑰花香、甜蜜果味）、十六酸乙酯（又称棕榈酸乙酯，奶油、果爵香）、油酸乙酯（花香）对轮次基酒的整体风味贡献最大，其中十六酸乙酯、油酸乙酯、己酸乙酯不仅在含量上是1～7轮次的“骨架酯”，在香气贡献层面上也是。苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯虽然含量不高，但是对整体风味具有明显贡献，因此从风味贡献层面断定此3 种酯类物质是轮次基酒中的“骨架酯”。酒体中含量最高的醇类是乙醇，由乙醇和其他酸类酯化后产生大量的乙酯类风味化合物。如高级脂肪酸乙酯，可以丰富酒体，延长酒的后味[33]；如L(-)-乳酸乙酯、硬脂酸乙酯，虽对酒体无明显风味贡献，但缺一不可。9,12-十八碳二烯酸乙酯、9-十六碳烯酸乙酯、13-甲基十四酸乙酯均未查到相关阈值报道，其具体风味贡献还需进一步研究，月桂酸乙酯（花香、果香）、十四酸乙酯（甜香、鸢尾油香）在1、2轮次OAV高于3～7轮次，证实了生产实践经验中酱香型白酒的1、2轮次基酒酱香不突出，粮香、甜香、蜜香、果香及花香较突出。3-苯丙酸乙酯苯丙酸乙酯（蜜菠萝香，蜂蜜香，花香）在1轮次中具有突出的香气贡献，结合基酒的生产实践，1轮次中蜜香十分典型，在此便给予了证实。王晓欣[15]在传统酱香型轮次酒中检出辛酸乙酯且对香气有重要贡献，在本研究中，戊酸乙酯（水蜜桃香，水果香，花香，甜香）、乙酸戊酯（甜香、果味香、熟梨香）、辛酸乙酯（白兰地酒香、甜香，花香）对3、4、5轮次的香气贡献突出，且在其余轮次中无香气贡献，由此判定该3 种化合物为3、4、5轮次中香气协调的关键酯类成分。仅有少数酯类物质在6、7轮次中具有香气贡献，且贡献程度均较弱，酯香微弱，从而导致风味结构不够协调，焦糊香突出。

3 结 论

酱香型白酒机械化酿造将是大势所趋，应用液液萃取结合气相色谱-质谱技术对风味化合物进行分离、检测。结果表明，机械化酿造与传统酿造轮次基酒间具有相似的风味结构，机械化酱香型轮次基酒间的风味结构具有显著差异，在酯、醇、酸、醛酮4 类主要风味化合物上的结构差异尤为突出，酯类物质在酱香型轮次基酒的风味结构中占有重要地位。从含量层面表明乳酸乙酯、乙酸乙酯、己酸乙酯、十六酸乙酯、油酸乙酯、9,12-十八碳二烯酸乙酯、十四酸乙酯、9-十六碳烯酸乙酯、硬脂酸乙酯、13-甲基十四酸乙酯10 种化合物是轮次基酒中的“骨架酯”；从风味贡献层面表明己酸乙酯、苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、十六酸乙酯、油酸乙酯5 种酯为酱香型白酒机械化酿造轮次基酒的“骨架酯”。1、2轮次的特征性酯类为3-苯丙酸乙酯、乳酸异戊酯、亚麻酸乙酯、甲氧基乙酸3-甲基丁酯、月桂酸乙酯、十四酸乙酯；3、4、5轮次的特征性酯类为戊酸乙酯、乙酸戊酯、辛酸乙酯；除油酸乙酯和十六酸乙酯外，6、7轮次中无特征性酯类，可将这些特征酯类化合物定性为“轮次基酒酯类标志成分”，为生产规范管理提供科学依据。本研究详细分析了机械化酱香型轮次基酒的主要挥发性风味结构及其特征酯类化合物，后期将进一步对除酯类外的风味化合物进行研究和分析。另外，在研究过程中发现，目前关于对白酒中风味物质阈值的系统性报道少之甚少，后期将对此进行系统性研究，为白酒风味化学的发展作出积极贡献。