酸凝pH值对乳扇凝团理化特性、蛋白结构及微观结构的影响

魏光强，王钰潭，毛兴菊，廖紫玉，杨 婧，黄艾祥

（云南农业大学食品科学技术学院，云南 昆明 650201）

乳扇是云南大理州白族人民的一种历史悠久、民族特色浓郁的传统酸凝拉伸型干酪，早在1563年明朝杨升庵所编著的《南诏野史》中就有“酥花乳线浮杯绿”的记载[1]。目前乳扇以手工加工为主，是将酸木瓜熬制的酸浆或经发酵后的酸乳清加热后，加入牛奶，酪蛋白酸凝后得到的凝乳团拉伸而成。拉伸成型是乳扇加工的关键、难点环节，而酸凝pH值对拉伸成型至关重要。

拉伸型干酪是指凝乳在热水中经过拉伸揉捏处理，使其具有独特的可塑性，同时赋予成品干酪特有的纤维结构、融化性和拉伸性。拉伸型干酪制作时的酸化pH值、凝乳时间以及堆酿温度等处理条件都会对其内部组成以及蛋白结构产生一定的影响[2-4]。周颖喆[5]、刘金博[6]、杜莹[7]等研究了热烫拉伸温度和拉伸次数对Mozzarella理化和功能特性，以及成熟期间品质特性的影响，表明热烫拉伸处理会使Mozzarella干酪的蛋白结构发生大幅度的改变，各组分也会重新分布并伴随着含量的变化，这一步骤对于Mozzarella功能特性的形成起着关键的作用。酸促凝胶是酸凝奶酪加工的关键环节，是指当新鲜牛乳的pH值降至酪蛋白的等电点附近时，酪蛋白胶束之间相互交联聚集，溶解度下降，最终形成网状乳凝胶的过程[8]。乳扇作为传统酸凝拉伸型干酪，其加工工艺为：酸乳清（pH＜3.2）经加热后添加牛奶，酸促凝胶得到乳扇凝团，凝团经热烫拉伸，晾晒后得到乳扇。加工过程中酸凝pH值与热烫拉伸条件为主要控制点，尤其是酸凝pH值对乳扇凝团的硬度、弹性、韧性、光滑程度具有重大影响，甚至决定了乳扇成型的成功与否。窦玉萍等[9]研究表明，在乳扇的生产过程中，热烫拉伸时凝块的pH值与温度等条件对产品的产量及风味有着重要的影响。虎砚颖等[10]研究了不同凝乳条件对传统乳扇品质的影响，得出风味的变化主要受凝乳方式的影响，而色泽、质构的变化则受凝乳方式和凝乳pH值的控制。综上所述，酸凝pH值对乳扇的拉伸成型影响较大。

研究以乳扇加工的酸凝pH值为条件，采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、傅里叶变换红外光谱、激光共聚焦扫描显微镜、激光粒径仪和质构仪研究不同酸凝pH值（4.2、4.5、4.8、5.1和5.4）对乳扇凝团的基本组分、质构、粒径，蛋白质降解和二级结构含量，以及微观结构的影响，探讨酸凝pH值对乳扇凝团理化特性、蛋白结构及微观结构的影响，分析酸凝pH值对乳扇拉伸成型的影响。以期为乳扇加工参数的选择提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

荷斯坦牛奶由云南德摩菲尔生物科技有限公司提供，其主要成分含量为：蛋白质3.1%，脂肪3.4%，总固体含量11.84%，乳糖4.88%，酸度13.38oT。酸乳清：由自主筛选的发酵乳杆菌与保加利亚乳杆菌发酵乳清而成，pH 3.17。

甘油、溴酚兰、考马斯亮蓝G250（均为分析纯）、异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate isomer，FITC）、Nile Red（均为色谱纯） 美国Sigma公司；丙烯酰胺、四甲基乙二胺（N,N,N′,N′-tetramethylethylenediamine，TEMED）均为分析纯美国Amresco公司；蛋白质Marker 北京Solarbio公司。

1.2 仪器与设备

FD-1A-50冷冻干燥机 上海比朗仪器制造有限公司；DYY-6C电泳仪 北京六一仪器厂；1658001垂直电泳槽美国Bio-Rad公司；TA.XT.plus质构仪 英国SMS公司；Nicolet iS10傅里叶变换红外光谱仪 赛默飞世尔科技（中国）有限公司集团；IX81激光共聚焦扫描显微镜 日本奥林巴斯公司；Rise-2002激光粒度仪 济南润之科技公司。

1.3 方法

1.3.1 乳扇凝团样品的制备

乳扇凝团制备工艺：酸乳清（80 mL，pH 3.17）→加热至80 ℃→添加牛奶（500 g）→调整pH值→加热凝乳（70 ℃）→乳扇凝团→热烫拉伸（温度70 ℃；时间110 s）。在调整pH值步骤中分别调整酸凝pH值至4.2、4.5、4.8、5.1、5.4，然后进行加热凝乳，制得5 组乳扇凝团，此外，按照上述乳扇凝团制备工艺，再次制备酸凝pH值为4.8的乳扇凝团，凝团经热烫拉伸处理制得拉伸组乳扇凝团，共6 组乳扇凝团。共制备两份乳扇凝团，一份置于4 ℃冰箱保藏，一份冻干制得冻干粉，备用。

1.3.2 乳扇凝团的理化成分测定

将1.3.1节制备的6 组乳扇凝团在4 ℃冰箱中放置12 h去除表面水分，分别参照GB 5009.3—2016《食品中水分的测定》、GB 5009.5—2016《食品中蛋白质的测定》和GB 5009.6—2016《食品中脂肪的测定》，测定6 组乳扇凝团的水分、蛋白质及脂肪含量。

1.3.3 乳扇凝团的粒径测定

使用Rise-2002激光粒度分析仪进行粒度分布测定。准确称取0.1 g不同组别的乳扇凝团冻干粉，利用激光粒度分析仪进行乳扇凝团粒径检测，选取D50值为颗粒平均直径，采用蒸馏水作为介质，设置超声时间1 min。

1.3.4 乳扇凝团的质构剖面（texture profile analysis，TPA）分析

采用TA-XT Plus质构仪测定6 组不同处理的乳扇凝团的硬度、弹性、内聚性、胶着性和咀嚼性，测定参数为探头类型P/36R、下降速率5 mm/s、测试速率1 mm/s、触发力2.0 N、形变量50%。

1.3.5 乳扇凝团的蛋白结构分析

1.3.5.1 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳

分别称取6 组乳扇凝团冻干粉，配制成质量浓度为1.5 mg/mL的样品溶液，按照样品溶液：上样缓冲液4∶1的比例制备1 mL的上样液，金属浴加热（95 ℃、10 min）；离心（4 ℃，8 000 r/min，2 min），取15 μL样品上样，采用体积分数4%浓缩胶与体积分数15%的分离胶进行电泳分离，电泳所用Marker的分子质量范围在10～180 kDa之间。电泳结束后，电泳胶片用考马斯亮蓝G-250染液染色1 h，用体积分数20%的甲醇与冰醋酸的混合液进行脱色至电泳条带清晰可见，电泳胶片使用Quantity One软件拍摄图像并进行分析。

1.3.5.2 酪蛋白二级结构相对含量测定

采用Nicolet iS10红外光谱仪进行红外分析。将冻干后的乳扇凝团样品平铺在采样器附件ZnSe晶片上，设置分辨率为4 cm-1，扫描范围为650～4 000 cm-1。选取酰胺III带（1 220～1 330 cm-1）的谱线范围，首先使用Peakfit 4.12对该谱线范围的图谱进行基线校正、去卷积并二阶求导，之后对得到的数据使用Origin 2018拟合函数曲线，最后根据各峰所属的蛋白质二级结构波段计算各峰的积分面积；其所属的积分面积即为相对含量。

1.3.6 乳扇凝团的微观结构测定

参照Ong等[11]的方法略作修改，将冻干后的乳扇凝团薄片置于1 mL 0.1 mg/mL的蛋白染液（FITC）和1 mL 0.04 mg/mL的脂肪染液（Nile Red）中浸泡30 min，倒去染液，使用超纯水洗涤3 次，之后将样品放至载玻片上，滴上1 滴甘油，用激光共聚焦扫描显微镜观察样品图像。

1.4 数据处理与分析

2 结果与分析

2.1 酸凝pH值对乳扇凝团理化特性的影响

2.1.1 对理化品质的影响

表1 各组乳扇凝团的理化组分Table 1 Physicochemical compositions of Rushan cheese curd samples

由表1可知，随着酸凝pH值的下降，乳扇凝团的蛋白、脂肪、水分质量和成品质量呈先上升后下降的趋势，当pH值为4.8时各组分质量和成品质量均达到最高值，原因是此时酪蛋白胶粒凝结成三维空间网络状结构的凝胶，酪蛋白胶束间的亲水基团相对较多，凝团持水性好；此外蛋白和脂肪之间的相互作用力能使乳扇凝团中的蛋白质和脂肪球紧密结合，最终使蛋白质，脂肪球和水分形成紧密的乳凝胶，提高乳扇凝团的产量和可塑性[12]。当酸凝pH值为5.4和5.1时，酪蛋白胶束刚发生解离，凝乳不彻底，凝团的各组分质量和成品质量低，且形成的凝团结构不稳定，质地较软，可塑性差；当pH值为4.5或4.2时，酪蛋白胶束之间的引力减弱，形成的酪蛋白胶束凝胶不稳定，对脂肪和水分包裹能力弱，形成细小的凝乳颗粒，凝团的各组分质量和成品质量低[12]。综上，酸凝pH值通过影响酪蛋白胶束间的作用力从而影响乳扇凝团的理化品质，当酸凝pH值为4.8时，乳扇凝团的各组分质量和成品质量最高，且乳扇易于拉伸成型。

2.1.2 酸凝pH值对乳扇凝团粒径的影响

表示粒度特征的关键指标中D10、D50、D90、D3、D97分别代表该样品的累积粒度分布的百分数达到10%、50%、90%、3%、97%对应的粒径值，其中D50表示样品的平均粒径，D97常用来表示粉体的最大粒径，D3常用来表示粉体的最小粒径[13]。不同处理组乳扇凝团粒度分布图以及粒径值如图1和表2所示。如图1所示，样品所含颗粒的粒径均在120 μm以下。

图1 各组乳扇凝团的粒径分布图Fig.1 Particle size distribution of Rushan cheese curd samples

表2 各组乳扇凝团的粒径值Table 2 Particle size parameters of Rushan cheese curd samples μm

由图1可知，随着酸凝pH值的下降，乳扇凝团的粒径分布逐渐趋近于正态分布，可能是由于随着乳扇酸凝pH值的下降，酪蛋白聚集形成稳定的凝胶结构，蛋白微粒形态之间更为接近。由表2可知，随着酸凝pH值的下降，乳扇凝团的D50、D3和D97均呈先降低后升高的趋势，酸凝pH值从5.4降至5.1时，磷酸钙的溶解导致了单体酪蛋白的解离，乳扇凝团的D50、D3和D97均显著降低[14]（P＜0.05）。当酸凝pH值由5.1降至4.8时，解离的单体酪蛋白之间互相聚合形成胶粒，凝团的粒径和黏度增大[12]，pH值为4.8时乳扇凝团的D50、D3和D97值分别为（26.74±0.11）、（4.61±0.04）μm和（61.19±0.23）μm，凝团表面光滑且结构稳定。而当酸凝pH值降至4.8以下时蛋白胶束虽然会发生聚集，但难以恢复到天然的紧密球状结构，因此导致粒径值显著增大（P＜0.05），酸凝pH值降至4.2时，乳扇凝团的D50和D97分别为（44.29±0.10）μm和（115.00±1.06）μm，形成颗粒状的凝乳[12]。综上，当酸凝pH值不低于4.8时，乳扇凝团粒径值较低，凝团细腻且质地柔软，当酸凝pH值低于4.8时，乳扇凝团粒径值大，凝团松散且质地较硬。

2.1.3 酸凝pH值对乳扇凝团质构特性的影响

表3 各组乳扇凝团的TPA分析Table 3 TPA analysis of Rushan cheese curd samples

硬度和胶着性能反映样品的组织状态和韧性，弹性能反映样品的黏性[15-17]。由表3可知，随着酸凝pH值的下降，乳扇凝团硬度值和咀嚼性显著升高（P＜0.05），内聚性显著降低（P＜0.05）；而弹性与胶着性随酸凝pH值的下降呈先上升后下降的变化趋势，但变化不显著（P＞0.05），二者同时在pH 4.8时到达最高值，说明此时的乳扇凝团具有较好的柔韧性和黏弹性。当酸凝pH值高于4.8时酪蛋白胶束形成松散的、无定形结构的聚集体，乳扇凝团质地较软，硬度、弹性和胶着性较低，而内聚性较高；当pH值低于4.8时酪蛋白胶束之间的引力减弱，形成的酪蛋白胶束凝胶持水性差，形成细小的凝乳颗粒，凝团的弹性内聚性和胶着性较低，而硬度较高[14]。

2.2 酸凝pH值对乳扇凝团蛋白结构的影响

2.2.1 酸凝pH值对乳扇凝团酪蛋白分子结构的影响

从图2可知，不同酸凝pH值的乳扇凝团酪蛋白分子基本相同，以分子质量分别为27.1 kDa和24.9 kDa的α-酪蛋白和β-酪蛋白居多，但分子质量约为19 kDa的κ-酪蛋白存在一定的差异。随着酸凝pH值的升高κ-酪蛋白条带灰度呈现先变浅后加深的趋势，在pH 4.8处条带灰度最淡，降解程度较高。κ-酪蛋白是组成酪蛋白胶束模型的表面物质，其表面毛发层较强的亲水性可包裹疏水性较强的α-与β-酪蛋白在溶液中形成稳定的胶束结构[18]，而当κ-酪蛋白含量降低后胶束表面破裂，各胶束内部的α-与β-酪蛋白通过磷酸钙相互聚集成为三维空间网状凝胶，聚集形成体积较大的凝胶结构[19-20]，而重新组合的三维空间胶束间的空隙被水分与脂肪填充，当κ-酪蛋白在大的凝胶表面重新形成保护层时，锁住了胶束内部的水分等其他物质并起到稳定作用，从而使凝团具有较强的持水性。综上，酸凝pH值影响κ-酪蛋白降解，进而影响乳扇凝团的质量，当酸凝pH值为4.8时，κ-酪蛋白降解程度高，利于乳凝胶的形成，且形成的乳扇凝团稳定性和持水性较好。

图2 各组乳扇凝团的电泳图谱Fig.2 SD-PAGE of proteins in Rushan cheese curd samples

2.2.2 酸凝pH值对乳扇凝团酪蛋白二级结构的影响

图3为6 个不同处理组乳扇凝团在酰胺III带的红外原始图谱的拟合图，其中1 290～1 330 cm-1波段对应α-螺旋结构，1 220～1 350 cm-1波段对应β-折叠结构，1 265～1 395 cm-1波段对应β-转角结构，1 245～1 270 cm-1波段对应无规卷曲[21]。对各条曲线进行去卷积并二阶求导后，使用OriginPro 2018进行曲线拟合并根据各波段的积分面积计算4 种酪蛋白的相对含量，其结果如表4所示。

图3 各组乳扇凝团的红外原始拟合图谱Fig.3 FTIR spectra of Rushan cheese curd samples

由表4可知，酪蛋白二级结构的相对含量随酸凝pH值的下降发生不同程度的变化，其中α-螺旋与β-折叠相对含量随着pH值的下降呈先下降后上升的趋势，在酸凝pH值为4.5时到达最低值，而β-转角与无规卷曲在酸凝pH值为4.5时相对含量最高，原因是此时pH值逐渐趋向于等电点，酪蛋白表面所带静电荷接近零，其离子强度的改变使得酪蛋白分子内的氢键受其影响，进而改变了二级结构的含量。研究表明，α-螺旋与β-折叠相对含量比值可以在一定程度上表征蛋白质内部结构的柔韧性，当α-螺旋/β-折叠数值越小时，蛋白柔韧性越大[22-23]；而较低的β-转角含量，能使蛋白的网状结构趋于稳定[24]，当酸凝pH值为4.8时乳扇凝团的α-螺旋/β-折叠的比值和β-转角相对含量最小，分别为0.398、20.55%，说明此时乳扇凝团的柔韧性好且结构较为稳定。综上，乳蛋白在酸诱导凝胶化过程中，蛋白质分子通过疏水性基团互联聚集形成三维网络结构，过程中伴随着二级结构的相互转化[25]，当酸凝pH值为4.8时，α-螺旋展开，其相对含量降低，导致α-螺旋/β-折叠比值小，凝团柔韧性和稳定性好。

表4 各组乳扇凝团的酪蛋白二级结构相对含量Table 4 Secondary structure contents of casein in Rushan cheese curd samples

2.3 酸凝pH值对乳扇凝团微观结构的影响

图4 各组乳扇凝团的CLSM图像Fig.4 CLSM images of Rushan cheese curd samples

如图4所示，当酸凝pH值低于4.8时，乳扇凝团中蛋白空隙较大，呈疏松的网状结构，此外凝团中的脂肪含量较少，且在脂肪球周围观察到少量空白处，表明蛋白质网络和脂肪球之间的相互作用很弱[26-27]。随着酸凝pH值的上升，乳扇凝团的蛋白质分布逐渐变得均匀且蛋白骨架变得更加饱满，凝团中脂肪的含量和体积也随之增大，脂肪分布变得均匀后又趋向于杂乱。其中酸凝pH值为4.8时，乳扇凝团中的脂肪球在蛋白质骨架上分布均匀且和蛋白质结合紧密，同时蛋白质的亲水基团能结合并包裹住水分，最终使蛋白质，脂肪球和水分形成均匀致密的乳凝胶[28-30]，乳扇凝团可塑性强，与苗颖等[31]研究结果一致。

3 结 论

在酸促凝乳时，κ-酪蛋白降解，蛋白质结构展开，乳蛋白变性聚集形成乳扇凝团，不同的酸凝pH值可以调控乳凝胶的理化特性和结构特征，制成质构各异的乳扇凝团。pH 4.8是形成结构致密、可塑性强乳扇凝团的最佳酸凝pH值，此时：κ-酪蛋白降解程度高，酪蛋白胶束内部的α-与β-酪蛋白通过磷酸钙相互聚集成为三维空间网状的乳凝胶，α-螺旋与β-折叠比值以及β-转角相对含量最小，分别为0.398和20.55%，乳扇凝团平均粒径值为（26.74±0.11）μm，凝团具有较高的胶着性和弹性，且各组分含量和产品质量最高。微观结构表明乳扇凝团中的脂肪球分布均匀有序，且与蛋白和水分形成紧密的乳凝胶，凝团可塑性强。当酸凝pH值偏离4.8时，乳扇凝团的平均粒径值增大，凝团结构松散，α-螺旋与β-折叠比值以及β-转角相对含量值高，乳凝胶稳定性差，持水率低，导致乳扇凝团产量低且质地过硬或过软，弹性和可塑性差。综上，酸凝pH值为4.8时形成的乳扇凝团结构致密、可塑性高，乳扇易于拉伸成型。研究以期为乳扇加工参数的选择提供科学依据。