壳聚糖/γ-聚谷氨酸负载黑米花色苷纳米粒的制备、表征及缓释性能

潘 飞，赵 磊，陈艳麟，郝 帅，张会敏

（北京工商大学，食品营养与人类健康北京高精尖创新中心，北京市食品添加剂工程技术研究中心，北京 100048）

黑米花色苷，是一类天然多酚类色素，源于黑米种皮[1]，主要包括矢车菊素-3-葡萄糖苷（cyanidin-3-glucoside，C3G）、芍药素-3-葡萄糖苷、牵牛花素-3-葡萄糖苷等，其中C3G含量最高，约占总色素含量的95%。花色苷具有多种生物活性，如抗氧化[2]、调解血脂[3]、改善肠道菌群[4]、抗炎[5]、预防肝损伤[6]等，对保健食品、医药加工和化妆品行业都具有重要意义。

花色苷极易受到温度、金属离子、光照等外界环境的影响，导致花色苷发生降解褪色，甚至失去生物活性[7]，极大限制了花色苷的开发和应用。此外，花色苷在体内的环境下稳定性差，生物利用率低[1]。近年多项研究表明，添加辅色剂可提高花色苷的稳定性，如儿茶素、迷迭香酸、丁香酸等酚酸类物质通过与花色苷分子结构相互作用，减少外界环境对花色苷的降解[8]，但在缓释和生物利用度方面并没有得到很好改善。相比较辅色剂而言，由多糖、蛋白质、脂质等生物可降解大分子构建的纳米微胶囊载体更能有效解决这些问题[9-10]，这为花色苷作为功能性天然色素的开发和应用带来了崭新的市场前景。

壳聚糖（chitosan，CS），又称脱乙酰甲壳素，是由几丁质经过脱乙酰作用得到的产物，具有良好的生物相容性、血液相容性、可自行降解代谢、无毒安全性高等特点[11]，这些优良的性能在纳米医药、食品、化妆品、生物医药工程等领域已经得到广泛的应用。γ-聚谷氨酸（γ-polyglutamic acid，PGA），是一种阴离子天然聚合物，易溶于水，并且无毒、生物相容性好及可降解[12]。研究表明，CS和PGA可在pH驱动下通过离子凝聚法形成纳米粒子[13]，对紫杉醇、硫酸链霉素、乳酸链球菌素等活性物质进行微胶囊化研究，结果表明，与微胶囊化前相比，胶囊化的产物在稳定性、缓释效果及生物利用率方面得到明显改善[14-16]。此外，贺博[17]采用CS和羧甲基CS包埋蓝莓花色苷，结果表明负载蓝莓花色苷的纳米粒在稳定性和胃肠缓释性方面均较包埋前显著提高。Chen Tan等[18]采用硫酸软骨素与CS制备的接骨木花色苷纳米粒也表现出良好的稳定性和抗氧化能力。然而，CS和PGA构建纳米载体在天然色素的应用研究较少，尚不清楚CS-PGA纳米载体对花色苷的稳定性及缓释性的影响，这些研究不仅有助于解决花色苷稳定性差的问题，还利于提高其对胃肠环境的耐受性和缓释性，极大拓宽了花色苷在食品领域的应用。

因此，本研究采用CS和PGA作为壁材，以C3G为代表的黑米花色苷作为活性物质进行纳米微胶囊化，并采用超高效液相色谱（ultra-high performance liquid chromatography，UPLC）法对花色苷含量进行测定，分别进行单因素试验和响应面试验，以粒径和包封率为指标，确定最佳制备条件。采用表征分析方法对纳米粒的粒径、多分散指数（polydispersity index，PDI）、Zeta电位及微观结构进行测试分析。利用体外模拟胃肠消化系统对黑米花色苷纳米粒进行缓释研究。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑米提取物（花色苷纯度≥25%） 湖北紫鑫生物科技有限公司；C3G（纯度≥98%） 成都曼斯特生物科技有限公司。

CS（脱乙酰度≥95%）、PGA 上海易恩化学技术有限公司；甲酸（色谱纯） 美国Mreda公司；乙腈（色谱纯） 美国Fisher Chemical公司；胃蛋白酶、猪胰液素 北京博奥拓达科技有限公司；冰乙酸 天津福晨化学试剂有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

6 000 Da透析袋 北京酷来搏科技有限公司；Eclipse plus C18（RRHD 1.8 μm，2.1 mm×50 mm）色谱柱、1290 UPLC仪 美国Agilent公司；HJ-6多头磁力搅拌器 北京天林恒泰科技有限公司；SU8020扫描电镜日本日立公司；真空冷冻干燥机 美国Labconco公司；电位粒径纳米分析仪 英国Malvern公司；HNY-100B台式温室振荡器 天津欧诺仪器有限公司；H1850台式离心机 北京天林恒泰科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黑米花色苷纳米粒的制备

称取一定量的CS溶解在1%体积分数乙酸溶液中，配制不同质量浓度的CS，搅拌2 h使溶液澄清透明，准确移取20 mL CS溶液于烧杯中，并加入不同质量的黑米花色苷提取物，使黑米花色苷达到一定浓度，搅拌1 h使其溶液澄清透明，用6 mol/L氢氧化钠溶液调节其pH值至4.5，然后慢慢滴加20 mL一定浓度的PGA水溶液，使PGA-CS呈一定质量比，滴加完毕后继续搅拌一定时间即完成制备，此操作均避光进行。

1.3.2 花色苷含量的测定

使用UPLC对样品中花色苷进行定量分析，色谱条件：色谱柱：Eclipse plus C18（RRHD 1.8 μm，2.1 mm×50 mm）；流动相：A为乙腈溶液（体积分数2%甲酸），B为水（体积分数2%甲酸）；梯度洗脱条件：0～2 min，5% A，95% B；2～10 min，5%～50% A，95%～50% B；10～12 min，50% A，50% B；12～14 min，50%～5% A，50%～95% B；14～16 min，5% A，95% B；流速0.2 mL/min；检测波长520 nm；柱温30 ℃；进样量1 μL。采用C3G（6.25、12.5、25、50、100、200 μg/mL）按上述方法进行测定，以C3G质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线（y=21.422x-81.882，R2=0.999 4），并计算样品中花色苷的含量。

1.3.3 包封率及载药率的计算

将制备好的黑米花色苷纳米粒溶液以12 000×g离心30 min，收集上清液，根据1.3.2节方法测定游离花色苷的含量，将沉淀物（黑米花色苷纳米粒）进行干燥称量，并代入公式计算包封率及载药量：

式中：W0为初始黑米花色苷质量浓度/（mg/mL）；W1为游离黑米花色苷质量浓度/（mg/mL）；W总为黑米花色苷纳米粒质量。

1.3.4 单因素试验

为考察单一因素对黑米花色苷纳米粒包封率的影响，在其他条件相同的情况下，分别选择不同黑米提取物质量浓度（0.5、1、2、3、4 mg/mL）、CS质量浓度（0.1、0.5、1、2、3 mg/mL）、PGA-CS质量比（1∶10、1∶4、1∶2、3∶4、1∶1）、pH值（3、3.5、4、4.5、5、5.5）和搅拌时间（0、30、60、90 min）进行研究。

1.3.5 响应面试验设计

采用SPSS 18.0对单因素试验结果分析，选出对载药纳米粒包封率影响较大3 个因素CS质量浓度（A）、PGA-CS质量比（B）和黑米提取物质量浓度（C）。每个变量水平分别以-1、0、1进行编码，因素和水平见表1。采用Design Expert 8.0.6对试验数据进行回归分析，对黑米花色苷纳米粒包封率和粒径的影响因素进行深入研究和条件优化，并做出响应面图，对响应值受多个变量影响的问题进行建模及分析预测。该模型通过最小二乘法拟合二次多项方程：

式中：Wi为响应值（包封率、粒径）；β0为常数；βi为线性系数；βii为二次项系数；βij为2 个因素间的交互作用系数。Xi和Xj为参数变量（A、B、C）。

表1 响应面试验因素水平设计Table 1 Code and level of independent variables used in response surface design

1.3.6 结构表征分析

1.3.6.1 粒径、PDI和Zeta电位

取一定量制备好的黑米花色苷纳米粒溶液，稀释至原浓度的1/10，采用马尔文激光粒度分析仪测定溶液状态下纳米粒平均粒径、PDI和Zeta电位，在25 ℃测试6 次取平均值。

1.3.6.2 扫描电镜观察

为了观察样品的表面形态，对冻干后的载药纳米粒进行扫描电镜测试。使用导电双面胶将样品固定在样品台上，喷镀铂金后进行观察。测试条件为放大倍率400 倍，加速电压3.0 kV，在电子显微镜下观察、拍照。

1.3.7 缓释研究

参考Hu Qiaobin等[19]的研究方法配制模拟胃肠液。将装有10 mg冻干黑米花色苷纳米粒的透析袋置于盛有50 mL的新鲜胃液（2.0 g/L氯化钠、2.917 g/L盐酸及1 mg/mL胃蛋白酶，pH（2.0±0.1）的锥形瓶中，然后使其在37 ℃、150 r/min的摇床上振荡，在固定时间取样。2 h后，向锥形瓶中加入90 mL新鲜肠液（0.616 g/L氢氧化钠、6.8 g/L磷酸二氢钾及10 mg/mL猪胰液素，pH（7.2±0.1），使其继续在37 ℃、150 r/min的摇床上振荡，在固定时间取样，采用未包封的黑米花色苷提取物作为对照，按照1.3.2节方法检测黑米花色苷含量，计算黑米花色苷释放率。

式中：Wt为黑米花色苷在消化液中的释放量/（mg/mL）；W0为初始黑米花色苷总添加量/（mg/mL）。

1.4 数据分析

采用SPSS 19.0和Design Expert 8.0.6软件对结果进行分析，数据以表示，采用t检验，P＜0.05，差异显著；P＜0.01，差异极显著。

2 结果与分析

2.1 制备条件单因素试验

黑米提取物质量浓度对包封率的影响结果表明（图1A），当黑米提取物质量浓度为2 mg/mL时，包封率最高为29.9%，之后黑米提取物质量浓度继续增加包封率降低，这可能是因为黑米提取物中存在一些电解质杂质影响着纳米粒的形成，过大的质量浓度不利于花色苷的包埋。

CS质量浓度及PGA-CS质量比对包封率的影响结果表明（图1B、C），随着CS质量浓度及PGA-CS质量比的增大，包封率呈现先升高后下降的趋势，在CS质量浓度为1 mg/mL和PGA-CS质量比为1∶2时包封率达到最大，分别为41.76%和42.45%，这是因为合适的壁材浓度和PGACS质量比反映2 种壁材离子交联的强度和稳定性，直接影响纳米粒包封率和性能[20]。

pH值对包封率的影响结果如图1D所示，包封率随着pH值的升高呈现先升后降的趋势，在pH 5.0时包封率最高，可达49.51%。这可能是因为在pH 5.0时所形成的纳米粒表面电荷相对稳定，有利于聚谷氨酸和CS通过离子交联，当pH值增大时，所形成的交联聚合物表面电荷降低，出现凝聚影响黑米花色苷的包埋[21-22]。

搅拌时间对包封率的影响结果表明（图1E），适当的搅拌时间有利于黑米花色苷的包埋，搅拌时间为30 min时包封率最高，可达49.78%。因为黑米花色苷纳米粒的形成是一个动态过程，适当搅拌有利于溶质的分散和纳米粒的粒径的均一，搅拌时间过长破坏了纳米粒之间的相互作用，发生碰撞和聚集导致包埋后黑米花色苷释放出来。从5 个单因素的结果显示，pH值和搅拌时间对包封率的影响相对较小，而黑米提取物质量浓度、CS质量浓度及PGA-CS质量比对包封率影响显著，因此，后续实验选择pH 5.0和搅拌时间30 min作为固定参数，对黑米花色苷的包埋条件进一步优化。

图1 包埋条件对黑米花色苷包封率的影响Fig.1 Effect of preparation conditions on the encapsulation rate of black rice anthocyanin-loaded nanoparticles

2.2 响应面优化试验

2.2.1 响应面结果与分析

根据单因素试验结果，以CS质量浓度（A）、PGACS质量比（B）、黑米提取物质量浓度（C）为自变量，粒径（W1）和包封率（W2）为因变量进行响应面试验，Box-Benhken试验设计及结果见表2，方差分析结果见表3。

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Box-Benhken design with response variables

采用Design Expert 8.0.6软件对表2试验数据进行多元回归拟合，得到CS质量浓度（A）、PGA-CS质量比（B）和黑米提取物质量浓度（C）与粒径（W1）和包封率（W2）的二次多项回归模型方程为：

表3 独立变量响应面模型方差分析Table 3 Analysis of variance of response surface quadratic polynomial models

从表3可以看出，所获得的回归模型均极显著（P＜0.01），失拟项均不显著（P＞0.05），R2＞0.95，说明模型有效且得到较好的预测值。一次项B、C对载药纳米粒的粒径和包封率影响均显著（P＜0.05），且B、C对粒径影响极显著（P＜0.01），一次项A对粒径影响显著（P＜0.05），而对包封率不显著；二次项B2和C2对粒径和包封率影响显著（P＜0.05），A2则不显著（P＞0.05）；交互相中除BC对粒径影响极显著（P＜0.01）外，其他均不显著（P＜0.05），可以看出这些因素影响着粒径大小和包封率的高低，而B和C的交互作用对粒径影响比较大。因此，通过对试验因素优化有利于设计形成粒径小且高封率高的纳米粒。此外，工艺参数对粒径和包封率影响大小依次为：B＞C＞A。

图2 响应面图为两两因素交互对粒径和包封效率的综合影响Fig.2 Response surface plots showing the individual and interactive effects of variables on the particle size and encapsulation efficiency

在模型中，当任一因素向响应曲线中点靠近时，粒径尺寸从754 nm降至342.57 nm。当因素超过中点时，粒径受到负向影响逐渐增大（图2、表2），较低浓度的PGA有利于形成小的粒径[23]。这可能是载药纳米粒在形成之前CS溶液呈连续凝胶状，随着PGA的加入，CS逐渐与PGA进行离子交联形成纳米粒，但PGA浓度升高，使PGA支链与CS进行横向结合产生较大的纳米粒[24]。

黑米花色苷纳米粒的包封率随所选3 种因素向响应曲线中点靠近而升高，包埋率在38.84%～52.11%范围内增大，当3 种因素逐渐超过中点时，包封率开始降低，这与其影响粒径的趋势相同。PGA-CS质量比和黑米提取物质量浓度分别在2∶5和2 mg/mL附近时，可以获得高包封率的载药纳米粒，随着黑米提取物质量浓度升高则包封率降低[25]。然而，CS质量浓度与包封率之间并未呈现正相关性，这与Feng Chao等[23]的结论不同，这可能是CS分子质量不同导致的，低分子质量更有利于包封，而高分子质量载药量高[26]。

此外，这些参数的用量也影响着粒径与包封率之间的关系，如PGA-CS质量比决定粒径的大小，但影响着包封率，而黑米提取物质量浓度决定包封率，也改变粒径。粒径较小时，随着黑米提取物质量浓度的增大导致黑米花色苷纳米粒的粒径增大，包封率也相应提高，但浓度过高时不利于纳米粒的稳定反而影响包封率。因此，选取了粒径最小、包封率最高为最佳优化条件，最终选择了CS质量浓度为0.8 mg/mL、PGA-CS质量比为7∶20和黑米提取物质量浓度为1.98 mg/mL作为后续研究的制备条件，粒径预测值为341.9 nm，包封率预测值为51.55%。

2.2.2 响应面模型验证

为了验证模型的有效性，在最优条件进行试验预测。所得制备载药纳米粒的结果：平均粒径为352.95 nm，包封率为50.90%，载药量为4.77%，与预测值相符。预测值与实验值之间的误差均小于5%。因此，从响应面回归模型可以准确地预测黑米花色苷纳米粒的粒径大小和封装效率。

2.3 表征学分析

粒径、Zeta电位和PDI是衡量纳米粒性能评价的重要标准，理想情况下，制备纳米粒应具有小的尺寸。Zeta电位值和PDI与分子稳定性有关，Zeta电位值越小，越容易发生凝聚至有溶质析出，多分散系数PDI值越小，表明纳米粒在溶液中分散效果越好，越稳定[27-28]。在最优制备条件，即CS质量浓度0.8 mg/mL、PGA-CS质量比7∶20、黑米提取物质量浓度1.98 mg/mL、pH 5.0和搅拌时间30 min时，测定黑米花色苷纳米粒的平均粒径为（352.95±6.42）nm，PDI为0.23±0.02，Zeta电位为（29.56±1.09）mV，这表明所制备的黑米花色苷纳米粒尺寸小，在溶液中分散效果良好，电位较高且稳定性好。

采用扫描电镜对冻干后的黑米花色苷纳米粒表面微观结构进行观察，并与空载纳米粒比较。由图3A可知，CS与聚谷氨酸通过离子凝胶作用形成，表面相对光滑平整，这是因为在冻干过程中内部中空的纳米粒发生团聚效应从而紧密排列，与Liang Tisong等[29]采用CS和硫酸软骨作为壁材制备纳米粒在扫描电镜下形态一致。在CS与PGA交联过程中，黑米花色苷被包裹在多聚物内部，形成黑米花色苷纳米粒，此外，由于离子交联是个动态过程，有部分黑米花色苷可能吸附在多聚物表面，从而在扫描电镜下其微观结构表面粗糙、呈现多颗粒、不规则形状（图3B），这表明负载黑米花色苷的纳米粒已经形成。

图3 扫描电镜下的空载纳米粒（A）和黑米花色苷纳米粒（B）Fig.3 Observation of nanoparticles (A) and black rice anthocyaninloaded nanoparticles (B) under SEM

2.4 黑米花色苷纳米粒体外缓释性研究

缓释实验能够模拟生物活性物质在人体消化道中释放情况，一方面衡量生物活性物质在胃肠液的稳定性、耐受性，另一方面衡量生物活性物质在胃肠液中的释放率，这对研究生物活性物质的运送及代谢至关重要，也是衡量纳米粒性能及稳定性的评价标准[30]。采用优化后的工艺进行制备纳米粒，按照1.3.3节方法进行离心，随后将沉淀物放入真空冷冻干燥机处理获得冻干的纳米粒，分别对冻干后的黑米花色苷纳米粒粉末及未包埋的黑米提取物进行胃肠液缓释作用研究，结果如图4所示。

图4 黑米花色苷在禁食状态下模拟胃肠道环境的释放率Fig.4 Anthocyanins release percentage during incubation in simulated gastrointestinal fluids under fasting condition

在胃液中，未包埋的黑米花色苷释放率为65.13%，而包埋后的黑米花色苷纳米粒中花色苷释放率显著降低，仅为30.84%。这说明由CS和PGA通过静电离子作用形成的聚合物，对包埋的黑米花色苷具有较好的缓释能力，延缓黑米花色苷在胃中的释放。在肠液中，黑米花色苷包埋前后的释放率均出现了显著下降，从花色苷的保留率上来看，未包埋的黑米花色苷远低于黑米花色苷纳米粒，这是因为花色苷在碱性条件容易发生降解[31]，而采用CS与PGA所构成的纳米载体恰好可以改善这一劣势。综合来看，相比较未包埋的黑米花色苷，黑米花色苷纳米粒在胃、肠液中释放率分别减少52.65%、36.69%，这表明所制备的黑米花色苷纳米粒具有明显的缓释效果，可以延缓黑米花色苷在胃肠液的释放。

3 结 论

本研究通过单因素试验和响应面试验优化CS/PGA包埋黑米花色苷的工艺，以包埋率和粒径为指标，确定最佳工艺为CS质量浓度0.8 mg/mL、PGA-CS质量比7∶20、黑米提取物质量浓度1.98 mg/mL、pH 5.0和搅拌时间30 min，所制备的黑米花色苷纳米粒包埋率为50.90%，载药量为4.77%，粒径为（352.95±6.42）nm，PDI为0.23±0.02，Zeta电位为（29.56±1.09）mV。采用二次模型拟合和验证实验表明该模型显著且相关性高。通过扫描电镜观察黑米花色苷纳米粒呈球形颗粒状；模拟胃肠缓释实验显示，黑米花色苷纳米粒具有明显的缓释作用，这表明所制备的纳米粒粒径较小、分散稳定、缓释性能较好，具有较好的应用前景。