高产α-半乳糖苷酶乳酸菌发酵对鹰嘴豆酸面团生化特性及其面包烘焙品质的影响

武 盟，曹伟超，程 新，马子琳，罗 昆，徐 岩，黄卫宁,*，李 宁，高铁成

（1.江南大学 食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡 214122；2.江南大学生物工程学院，酿造微生物与应用酶学研究室，教育部工业生物技术重点实验室，江苏 无锡 214122；3.广州焙乐道食品有限公司，广东 广州 511400）

面包等烘焙食品是世界主流食品，使用鹰嘴豆粉替代小麦粉可以提高面包蛋白质含量，补充小麦等谷物缺少的赖氨酸[1]。但鹰嘴豆含有大量的棉子糖、水苏糖，Gangola等[2]报道2 种糖总量质量分数约为1.85%～2.78%（以干物质计），这些抗营养因子会降低营养物质在人体内的消化吸收[3]，引起胀气、腹泻等症状。此外，鹰嘴豆面包较差的质构和风味特性也严重限制其消费者可接受性[3]。酸面团是公认安全的生物发酵技术，在发酵过程中积累的有机酸、氨基酸可以赋予产品特殊风味[4]。众多国内外学者选择使用酸面团发酵技术降低棉子糖、水苏糖含量和改善面包烘焙和风味品质。Martínez-anaya[5]将酸面团技术应用在面包中，提升了面包风味；Galli等[3]使用植物乳杆菌预发酵鹰嘴豆粉，减少豆粉中63.22%的棉子糖和水苏糖；苏晓琴[6]使用布氏乳杆菌发酵绿豆酸面团，制作的面包比容及质构得到显著提升，但其菌株缺少α-半乳糖苷酶活性，未能将豆粉中的棉子糖、水苏糖去除。α-半乳糖苷酶可切割棉子糖和水苏糖的α-1,6糖苷键，将其水解为半乳糖和蔗糖。因此使用高产α-半乳糖苷酶乳酸菌发酵鹰嘴豆酸面团可能是减少鹰嘴豆粉棉子糖含量、改善面包风味及质构特性的有效手段。

本研究利用高产α-半乳糖苷酶乳酸菌发酵鹰嘴豆粉，探究其对鹰嘴豆酸面团生化特性及鹰嘴豆面包烘焙特性的影响，为改善鹰嘴豆面包品质的相关研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

棉子糖、水苏糖标准品（色谱纯） 美国Fluka公司；乳酸、乙酸标准品（色谱纯） 美国Sigma公司；面包粉 中粮面业（秦皇岛）鹏泰面粉有限公司；发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）C2-8筛选自茅台酒曲；干酵母 安琪酵母股份有限公司；黄油 中粮食品营销有限公司；白砂糖、食盐 市售；鹰嘴豆粉新疆天山奇豆生物科技有限责任公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

SPC-40SP型醒发箱、SM-523型烤箱 新麦机械（无锡）有限公司；1100型高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪 美国安捷伦公司；CT 3型质构仪 美国Brookfield公司；80 μm CAR/PDMS固相微萃取头 美国Supelco公司；TSQ Quantum XLS三重四极杆气相色谱-质谱联用仪美国赛默飞世尔科技公司；Smart Tongue电子舌系统美国Isenso公司。

1.3 方法

1.3.1 鹰嘴豆酸面团（chickpea sourdough，CSD）的制作

参考杨文丹等[7]的方法制备酸面团。发酵乳杆菌C2-8在MRS培养基中培养至指数生长期后期（18 h），取10 mL发酵菌液于4 ℃、6 000 r/min离心10 min，无菌生理盐水洗涤2 次，获得菌泥。取50 g鹰嘴豆粉和50 g灭菌蒸馏水，加入获得的菌泥，制备CSD，在37 ℃培养24 h。

1.3.2 酸面团有机酸含量的测定

根据王益姝[8]的方法测定酸面团有机酸含量。在0～24 h内每4 h称取10.0 g酸面团样品，加入20.0 mL超纯水，高速搅拌5 min，之后在4 ℃、12 000 r/min离心20 min，取上清液过水相0.22 μm膜后，通过HPLC测定样品中的乳酸和乙酸含量。流动相：0.01 mol/L磷酸氢二铵（pH 2.8）缓冲液-甲醇（97∶3，V/V）；柱温25 ℃；流速0.7 mL/min；紫外检测器波长：215 nm；进样量：20.0 μL。每个样品重复3 次，取平均值。

1.3.3 酸面团棉子糖及水苏糖含量的测定

样品制备：精确称取10.00 g发酵0、8、16、24 h酸面团样品，使用石油醚回流除去脂肪，以料液比1∶10（V/V）加入80%乙醇溶液，80 ℃回流1 h，抽滤后收集滤液。滤渣中加入100 mL水并搅拌1 h，之后抽滤。2 次滤液合并，使用质量分数10%醋酸铅溶液沉淀蛋白，之后于4 ℃、10 000 r/min离心20 min，重复2 次至蛋白除尽，再用草酸除去沉淀蛋白留下的铅。之后真空浓缩到100 mL，进行HPLC分析[9]。每个样品重复操作3 次，取平均值。

色谱条件：色谱柱为Bridge BEH Amide柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为乙腈-水（70∶30，V/V）；柱温35 ℃；流速1.0 mL/min；进样量20.0 μL；示差折光检测器，检测池温度35 ℃[9]。

1.3.4 酸面团还原糖含量的测定

根据张可欣[10]的方法测定还原糖含量。称取2.5 g发酵第0、8、16、24小时酸面团样品，加入0.1 mol/L NaOH溶液5 mL使淀粉酶失活，之后加入17.5 mL蒸馏水，45 ℃振荡水浴1 h，冷却后定容至50 mL，静置沉淀2 h。吸取适量上清液于50 mL容量瓶中，加入0.1 mol/L乙酸锌溶液和0.1 mol/L亚铁氰化钾溶液各1 mL，以沉淀蛋白质淀粉等大分子，定容后静置30 min取上清液，上清液即为测定液。取1 mL上清液于10 mL试管中，加入2 mL 3,5-二硝基水杨酸试剂，补水至5 mL，混匀后沸水浴5 min，流水冷却，最后加水至10 mL混匀，在520 nm波长下测定吸光度。根据吸光度和葡萄糖标准曲线计算还原糖含量。

1.3.5 酸面团游离氨基酸水平的测定

根据刘若诗[11]的方法测定酸面团游离氨基酸。称取10.00 g面团样品，加入25 mL质量分数5%的三氯乙酸溶液高速匀浆30 s，在10 000 r/min离心10 min，两层滤纸过滤，上清液于10 000 r/min离心10 min，取上清液过0.22 μm滤膜后即为测定液。

HPLC测试条件：醋酸钠-乙腈-甲醇（1∶2∶2，V/V）；紫外检测器波长：338、262 nm；色谱柱：ODS Hyoersil柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流速：1.0 mL/min；柱温：40 ℃。每个样品重复3 次。

1.3.6 鹰嘴豆酸面团面包（chickpea sourdough bread，CSB）的制作

表1 CB和CSB的配方Table 1 Formulations of chickpea bread and chickpea sourdough bread

实验组为CSB，对照组为普通鹰嘴豆面包（chickpea bread，CB）。面包的配方见表1。参照杨紫璇等[12]的方法并略作修改。流程：提前溶解糖和盐，除黄油外将所有原料倒入搅拌缸，慢搅3 min，快搅1 min；加入黄油，之后慢搅2 min，快搅3 min。取出面团滚圆，松弛5 min，分割成90 g，再次松弛10 min后整形，置于面包模具，在醒发箱中醒发100 min，醒发箱参数：温度38 ℃，相对湿度85%，放入烤箱烘烤20 min，烘烤温度：上火170 ℃，下火200 ℃。

1.3.7 面包全质构分析

面包室温冷却2 h后，用切片机将面包切成10 mm厚度的薄片，将中间的两片叠加，使用质构仪测定质构。参数：50%形变，触发点负载5 g，测试速率3.00 mm/s，探头型号TA36，循环次数2 次[13]。

1.3.8 面包比容测定

面包室温冷却2 h后，用油菜籽法[13]测定面包比容。

1.3.9 面包挥发性风味化合物的测定

称取5.0 g面包样品置于20 mL样品瓶，盖上盖子，插入已经老化的固相微萃取头，60 ℃顶空萃取40 min，进行气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）联用分析[14]。

色谱条件[15]：DB-5MS毛细管色谱柱（60 m×0.32 mm，1 μm），载气为氦气，以10 mL/min恒流1 min后，在分流比10∶1的模式下分流。升温程序：40 ℃保温2 min，以升温速率6 ℃/min升温至160 ℃后保温2 min，之后以升温速率10 ℃/min升温至230 ℃后保温7 min。

质谱条件：电离方式为电子电离，电子能量为70 eV，温度设定在230 ℃。GC-MS分析图通过计算机和人工检索处理，与NIST Library和Wiley Library进行数据匹配。

1.3.10 电子舌对面包的滋味分析

参考何晓赟[16]的电子舌测试方法对面包的滋味进行分析。取100 g面包样品并粉碎，加入300 mL去离子水，均质10 min之后，在4 ℃、3 000 r/min离心10 min，取上清液通过Smart Tongue电子舌系统进行测试。将100 mL样品液倒入100 mL烧杯中，数据采集中以清洗液（蒸馏水）和萃取液（样品上清液）交替进行，为使传感器响应值趋于平稳，每个样品采集时间为120 s，每隔1 s 采集一个数据，采集完毕清洗20 s。为减少测量误差，取最后10 s测量值的平均值作为各传感器的后续处理数据。

1.3.11 面包感官评定

感官评价：20 位经培训的人员（男女比例1∶1）组成感官评定小组，采用9 分嗜好法对面包的外观、颜色、风味、口感、内部结构和整体可接受度进行评定[12]，其中1～9分别表示极度不喜欢、非常不喜欢、正常不喜欢、轻微不喜欢、不喜欢也不讨厌、略微喜欢、正常喜欢、非常喜欢和极度喜欢。

1.4 数据分析

所有实验数据通过Excel 2013、Origin 2018和进行统计分析，使用SPSS 19.0软件进行显著性分析，P＜0.05，差异显著。

2 结果与分析

2.1 酸面团发酵过程中有机酸含量的变化

图1为CSD发酵过程中有机酸含量的变化。就乳酸含量变化而言，发酵0～12 h乳酸含量缓慢增长，12～16 h乳酸生成速率加快，在发酵至第24小时基本稳定。最终产生62.67 mmol/kg乳酸和15.53 mmol/kg乙酸。酸面团发酵熵（乳酸与乙酸的比值）为4.03，接近最适范围（1.5～4）[3]。酸面团酸度会影响多种内源性水解酶活力，有机酸的积累会降低酸面团pH值影响豆粉内源性蛋白酶[17]和α-半乳糖苷酶活性[3]，进而影响蛋白和棉子糖的酶解。此外，有机酸积累也对面包风味及质构产生影响[4]。

图1 发酵过程中CSD有机酸含量变化Fig.1 Changes in organic acid contents during chickpea sourdough fermentation

2.2 酸面团发酵过程中棉子糖、水苏糖及还原糖含量的变化

由图2可知，随着发酵的进行，CSD棉子糖、水苏糖逐渐被降解，水苏糖的降解速率一直高于棉子糖，Gote等[18]发现与棉子糖相比，水苏糖与α-半乳糖苷酶有更高的亲和力，C2-8可能会优先水解水苏糖，Carrera-Silva等[19]也认为水苏糖诱导酶的能力强于棉子糖；发酵8～16 h，棉子糖水苏糖含量进一步降低；发酵16 h后，随着棉子糖浓度的降低，降解速率变慢，而水苏糖仍以很高的速率降解，发酵24 h左右CSD棉子糖和水苏糖完全被降解。与国内外学者的研究结果[3,20-23]相比，使用C2-8降解CSD中的棉子糖和水苏糖，所需的发酵时间更短，降解率更高。这可能是由于C2-8本身具有较高的α-半乳糖苷酶活性，酸面团酸度也会影响酶活性[3]。随着发酵的进行，CSD有机酸逐渐积累，酸度逐渐降低，接近酶的最适酸度，α-半乳糖苷酶活性提高，此外酸化作用也会促进棉子糖和水苏糖降解[3]。

如图2所示，CSD还原糖含量不断增加，发酵0～16 h期间急剧增长，16～24 h增长变缓，第24小时含量达到11.50%。CSD还原糖含量与棉子糖、水苏糖含量呈负相关，可能是由于α-半乳糖苷酶可以将棉子糖、水苏糖等非还原性糖水解为半乳糖和蔗糖[24]，蔗糖进一步水解生成果糖和葡萄糖等还原性糖，从而增加还原性糖含量。葡萄糖等还原性糖的积累不仅有利于乳酸菌生长，还可以在面包面团发酵期间为酵母提供碳源，促进其发酵产气，从而提高面包比容[25]。

图2 CSD发酵过程棉子糖、水苏糖和还原糖含量变化Fig.2 Changes in raffinose, stachyose and reducing sugar contents during chickpea sourdough fermentation

2.3 酸面团发酵前后游离氨基酸含量的变化

图3 CD和CSD的游离氨基酸含量Fig.3 Free amino acid contents of CD and CSD

面团中的游离氨基酸代表其营养价值水平，同时也是面包挥发性风味化合物的前体物质[4]。图3为未发酵鹰嘴豆面团（chickpea dough，CD）和发酵24 h CSD的游离氨基酸含量。发酵前CD的总游离氨基酸含量为220.01 mg/100 g，经乳酸菌发酵24 h后，CSD的达到497.51 mg/100 g，是CD的1.26 倍。CSD的必需氨基酸含量为198.00 mg/100 g，是CD含量的4.96 倍，乳酸菌发酵后必需氨基酸占总游离氨基酸比重也明显提高，从CD的15.09%提高到CSD的39.80%。谷氨酸、丙氨酸、丝氨酸、甘氨酸对于增强鲜味至关重要[26]，经乳酸菌发酵后分别提高了20.50、40.02、26.11、18.05 mg/100 g，亮氨酸和苯丙氨酸可生成异戊醇和苯乙醇[4]。

赖氨酸是碱性必需氨基酸，在谷物中含量很低，且在加工过程中易被破坏，是第1限制性氨基酸[1]，鹰嘴豆粉中含有较多赖氨酸，经C2-8发酵后赖氨酸含量进一步提高，CSD从CD的2.51 mg/100 g提高到21.05 mg/100 g，提高了7.4 倍。乳酸菌发酵可以明显提高面包的游离氨基酸含量以及必需氨基酸所占比重，一方面是酸面团的酸性环境激活了谷物内源性的蛋白酶，促进蛋白水解[17]；另一方面是乳酸菌本身的肽酶可以将蛋白酶水解后的多肽分解为游离氨基酸和一些风味物质前体[27]。

2.4 面包的比容及质构

图4 CSB（左）及CB（右）的图片Fig.4 Pictures of CSB (left) and CB (right)

表2 CB和CSB的比容及质构Table 2 Specific volume and texture properties of CB and CSB

比容和质构是评价面包烘焙品质的重要指标。由图4可知，乳酸菌C2-8发酵后明显提高CB的比容，CSB较CB比容提高4.60%。酸面团的酸度会影响面包的比容，若酸度过高，可能会使面包中的面筋蛋白和淀粉等与面包结构相关的物质水解，面包结构弱化，比容降低，适宜的酸度有利于酵母发酵，增加面团面筋胶体的膨润和吸水，软化面筋，增大延伸性[27]。乳酸菌发酵产生的代谢产物也可被酵母消耗，例如棉子糖和水苏糖可被酶解为葡萄糖和果糖，提高酵母发酵产气能力，增加面包比容[25]。两种面包的回复性及内聚性无显著差异（表2）。与CB相比，CSB硬度降低18.49%，咀嚼性降低15.64%。弹性与面包品质呈正相关，硬度、咀嚼性与面包品质呈负相关[28]。全质构数据表明，酸面团发酵技术整体改善了CB的质构特性。

2.5 面包的挥发性风味化合物分析

表3 CB和CSB的挥发性风味化合物Table 3 Volatile flavor compounds identified in CB and CSB

续表3

表4 CB和CSB挥发性风味化合物类别统计Table 4 Statistics of volatile flavor compounds in CB and CSB

由表3、4可知，CB和CSB分别检测出50、49 种风味物质，主要包括醇类，醛类、酯类、酸类、酮类、烷烃类以及芳香杂环类化合物。烘烤过程中的高温使酶及微生物失活，美拉德反应及脂肪酸氧化成为风味化合物的主要来源[29]，如2-庚烯醛和2,4-癸二烯醛由脂肪酸氧化生成[30]，糠醛是美拉德反应标志产物，酸性环境下有利于糠醛的生成[31]。

图5 CB和CSB挥发性风味化合物分布雷达图Fig.5 Radar chart for the composition of volatile flavor compounds in CB and CSB

图5 为2 种面包挥发性风味化合物类别分布雷达图。乳酸菌发酵后，CSB的醇类、酸类、酯类、酮类风味化合物峰面积较CB有明显提高，分别提高11.78%、298.12%、103.78%、47.81%。CSD总游离氨基酸含量明显高于CD，证明了乳酸菌发酵可以明显提高面团总游离氨基酸含量。这可能是由于酸面团发酵积累了有机酸，从而影响面团的酸化程度并改善了蛋白水解作用，生成的肽和氨基酸为面包风味物质的前体，例如苯丙氨酸可通过Ehrlich途径生成苯乙醇[32]。结合表3分析，两种面包之间醇类主要差异物质为乙醇、苯乙醇和蘑菇醇，CSB的这3 种醇均高于CB，其中苯乙醇峰面积是CB的2.04 倍。乙醇具有酒香，苯乙醇具有玫瑰香气，蘑菇醇具有蘑菇、玫瑰、薰衣草和干草香气，且风味阈值较乙醇和苯乙醇低[4]。酸类主要差异物为乙酸，CSB的乙酸含量是CB的7.21 倍，这是C2-8发酵过程有机酸积累的结果。CSB的3-羟基-2-丁酮峰面积较CB高47.77%。3-羟基-2-丁酮又名乙偶姻，是一种重要的食用香料，可以赋予面包乳香味。虽然酯类物质峰面积较低，但其风味阈值也相对较低，对风味的贡献不可忽略[33]，CSB的酯类风味化合物峰面积为41.85×107，是CB的2.04 倍，这可能也与棉子糖降解对酵母的发酵促进作用有关，棉子糖和水苏糖的降解为酵母提供果糖和葡萄糖等风味前体物质[4]。CSB的乳酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸乙酯、丁酰乳酸丁酯、丁位癸内酯峰面积分别较CB显著增加（P＜0.05）。乳酸乙酯具有果香，CSB高含量的乳酸乙酯可能与其本身发酵生成的乳酸以及酵母发酵产生的乙醇有关；Birch等[34]报道癸酸乙酯具有椰子香型香气，乙酸乙酯具有水果香味，丁酰乳酸丁酯具有柔和的奶油和烤面包香气，丁位癸内酯强烈的奶香、坚果香、香甜的水果香气。此外，乳酸菌发酵也提高了面包癸醛、椰子醛以及吲哚的峰面积，低浓度的癸醛具有果香味，椰子醛具有强烈的椰子香味，低浓度的吲哚也有香味[34]。综合考虑，乳酸菌发酵明显提高面包挥发性风味化合物的峰面积，CB的风味得到改善。

2.6 面包的滋味分析

图6 CB和CSB的滋味分析雷达图Fig.6 Radar chart for taste analysis of CB and CSB

由图6可知，CSB酸味明显高于CB，这与C2-8发酵产生的乙酸有关，适宜的酸味可以改善面包口感，并且掩盖豆粉的豆腥味[6]。CSB的咸味也高于CB，咸味不仅与面包中盐的添加量有关，也与乳酸菌发酵密切相关[35]，Zhao等[36]报道罗伊氏乳杆菌发酵积累的部分游离氨基酸，例如谷氨酸，可以提高面包咸味，从而减少面包盐含量，低钠食品可以减少患高血压和心血管疾病的风险[35]。谷氨酸的积累不仅可以增加面包咸味，还能够提高面包鲜味，此外丙氨酸、丝氨酸、甘氨酸的积累对于增强鲜味也至关重要，这也可以解释CSB较CB有更好的鲜味和鲜味回味[26]。CSB较CB甜味明显提高，谷氨酸是鲜味氨基酸与甘氨酸的甜味有协同效应，而且Lock[37]报道α-半乳糖苷酶可以提高酶解后豆粉的甜味并掩盖苦味，Lindsay[38]认为大多数苦味物质拥有与甜味分子相同的受体，棉子糖、水苏糖降解后半乳糖和蔗糖的增加降低了面包的苦味，这可能是通过甜味分子竞争苦味受体而实现的。Heenan等[39]报道某些挥发性风味化合物与面包滋味可能存在正负相关性，CSB较高的乙酸含量会提高面包酸味，酸面团发酵后反式-2-壬烯醛、3-羟基-2-丁酮、糠醛含量的提高可能会提高面包的甜味，苯乙醇可能与甜味负相关，乙酸、乳酸乙酯可能与面包的苦味正相关，CSB较低的辛酸、壬醛、癸醛则有可能获得消费者对面包新鲜度的积极评价。乳酸菌发酵后明显提高面包的甜味、酸味、咸味、鲜味和鲜味回味，面包的滋味品质得到整体改善。

2.7 感官评定

感官评定的口感指标与面包质构密切相关，是评估消费者接受度的重要参数。由图7可见，乳酸菌发酵后，CB比容和质构得到明显改善，CSB外观饱满、质地松软、不粘牙不掉渣，外观和口感评分优于CB，并且CSB因更浓的香气及更好的滋味获得更高的风味评分，这与风味及滋味分析结果一致。还原糖含量的增加促进了面包的美拉德反应，面包颜色更深，因此除色泽外CSB均获得较高评分，整体可接受度达到7.2 分。

乳酸菌发酵酸面团过程中，蛋白水解的游离氨基酸是挥发性风味物质的前体化合物，这些氨基酸对面包的咸味、鲜味等滋味也有积极影响。乳酸菌发酵可以改善面包甜味、酸味、咸味、鲜味和鲜味回味等滋味，掩盖豆粉的豆腥味[6]。C2-8发酵将棉子糖、水苏糖降解为半乳糖和蔗糖，这些次级代谢产物为酵母发酵提供能量，促进其发酵产气，增大产品比容并且生成更多香气物质[25]，发酵还可以减少豆粉中膳食纤维对面筋的破坏[6]，使面包质构更加均匀、松软，改善面包口感。总体而言，乳酸菌发酵可以明显改善CB感官特性，提高其消费者可接受度。

图7 CB和CSB的感官评定图Fig.7 Sensory evaluation of CB and CSB

3 结 论

发酵24 h后酸面团产生62.67 mmol/kg乳酸和15.53 mmol/kg乙酸，酸面团棉子糖及水苏糖完全被降解，还原糖达到11.50%，总游离氨基酸含量、必需氨基酸比重及赖氨酸含量较CD显著提高（P＜0.05）。烘焙品质方面，CSB比CB比容提高4.60%，硬度降低18.49%，咀嚼性降低15.64%。风味特性方面，乳酸菌发酵后明显提高醇类、酸类、酯类、酮类风味化合物峰面积，其中苯乙醇峰面积提高1.04 倍，咸味、鲜味、酸味等滋味均优于CB，风味特性整体得到改善。除色泽评分外，CSB其他感官评定指标得分均高于CB，整体可接受度达到7.2 分。实验证明，使用高产α-半乳糖苷酶乳酸菌发酵CSD在增加有机酸、游离氨基酸含量，减少鹰嘴豆粉棉子糖、水苏糖含量，改善面包风味及质构特性等方面具有良好的应用潜力。