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槲皮素对氧化条件下猪肉肌原纤维蛋白结构及凝胶特性的影响

2021-06-04金伯阳刘登勇

食品科学 2021年10期
关键词:肌原纤维巯基槲皮素

贾 娜,孙 嘉,刘 丹,金伯阳,刘登勇

(渤海大学食品科学与工程学院,生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心,辽宁省食品安全重点实验室,辽宁 锦州 121013)

肌肉中最基本的组织是肌原纤维,肌原纤维由肌原纤维蛋白组成。在肉制品加工和贮藏过程中,肌原纤维蛋白易发生氧化,导致蛋白质结构和功能特性发生改变,最终影响产品品质。植物多酚作为天然抗氧化剂的一种,具有很强的抗氧化和清除自由基的能力。这些酚类物质能够抑制肉品中脂肪和蛋白氧化的程度,如将迷迭香、丁香、桂皮提取物添加到速冻肉丸中,可有效延缓脂肪氧化[1]。迷迭香提取物还可以减少博洛尼亚香肠中蛋白质羰基氧化产物的生成[2]。富含多酚的黑加仑提取物具有较强的自由基清除能力和还原能力,能够抑制猪肉中的脂肪氧化和蛋白氧化[3]。

虽然抗氧化剂的添加可以抑制蛋白的氧化,但是抗氧化剂也可以与蛋白发生相互作用,从而对蛋白的结构和功能特性产生影响。如高添加量的没食子酸(150 μmol/g)、绿原酸(150 μmol/g)会改变肌原纤维蛋白的结构,降低凝胶性[4-5]。表没食子儿茶素没食子酸酯也会导致肌原纤维蛋白结构改变,促进巯基和游离氨基的损失,蛋白质发生交联聚集,蛋白质的凝胶特性被破坏[6]。因此,明确多酚类物质引起的蛋白质结构和交联聚集程度的改变对于阐明多酚类物质对蛋白质功能性质的影响具有重要作用。

槲皮素为类黄酮类化合物,共有5 个酚羟基,具有一定的抗氧化活性。有研究表明,槲皮素可以抑制猪肉蛋白质羰基的产生,减缓蛋白氧化的过程,但其抗氧化效果与浓度相关[7]。Fenton氧化体系可以形成大量的羟自由基,可诱导蛋白质发生氧化反应[8]。故本研究选取Fenton氧化体系,以槲皮素作为抗氧化剂加入到肌原纤维蛋白氧化体系中,通过对蛋白的巯基含量、表面疏水性、电泳、凝胶强度、保水性、微观结构、流变特性以及水合特性进行测定,研究槲皮素添加量对肌原纤维蛋白结构及凝胶特性的影响,为深入研究多酚类抗氧化剂对肌肉蛋白功能特性及肉品品质的影响提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猪背最长肌、猪肥膘,购于当地超市。

槲皮素 美国Sigma公司;氢氧化钠、甘油、磷酸氢二钠、三氯乙酸、乙醇、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸、尿素、5,5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(5,5′-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid),DTNB)、溴酚蓝、冰乙酸、β-巯基乙醇等试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

Allegra 64R冷冻离心机 美国Beckman公司;T25数显型均质机 德国IKA集团;UV-2550紫外-可见光分光光度计 日本Shimadzu公司;Mini电泳仪、电泳槽美国Bio-Rad公司;TA-XT2i质构仪 英国Stable Micro Systems公司;S4800场发式扫描电镜 日本日立公司;Discovery DHR-1流变仪 美国TA公司;低场核磁共振分析仪 上海纽迈电子科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 肌原纤维蛋白的提取及氧化体系的构建

猪肉肌原纤维蛋白的提取按照Park等[9]的方法进行。用双缩脲法测定提取出的蛋白质浓度,并利用牛血清蛋白作为标准蛋白测定蛋白含量。

氧化体系的构建参照Cao Yungang等[4]的方法进行,并做适当修改。提取的肌原纤维蛋白溶解于pH 6.0 10 mmol/L磷酸缓冲溶液(含0.6 mol/L NaCl),随后添加10、50、100、150 μmol/g的槲皮素(以蛋白计),并向其中添加羟自由基氧化体系(10 μmol/L FeCl3、100 μmol/L VC和1 mmol/L H2O2),使蛋白最终质量浓度为40 mg/mL。对照组为未氧化的肌原纤维蛋白以及氧化后未加槲皮素的肌原纤维蛋白。蛋白样品均在4 ℃反应12 h。

1.3.2 巯基含量的测定

按照Di Simplicio等[10]的方法,使用Ellman’s试剂法测定蛋白质的总巯基含量。配制10 mg/mL的肌原纤维蛋白溶液,取1 mL蛋白质溶液加入8 mL Tris-甘氨酸,混匀后10 000 r/min离心15 min,除去不溶性蛋白质。取上清液4.5 mL与0.5 mL 10 mmol/L的Ellman’s试剂反应,并以含有4.5 mL Tris-甘氨酸和0.5 mL 10 mmol/L的Ellman’s试剂作为对照,反应30 min后,用紫外分光光度计在412 nm测吸光度。采用13 600 L/(mol·cm)的摩尔吸光系数计算巯基含量,蛋白含量使用双缩脲法测定。

1.3.3 表面疏水性的测定

参照Chelh等[11]的方法,将肌纤维蛋白溶于20 mmol/L磷酸缓冲溶液(pH 7.0),制备质量浓度为5 mg/mL的蛋白质溶液,取1 mL蛋白溶液加入200 μL 1 mg/mL溴酚蓝,充分混合,然后在6 000 r/min离心15 min,取上清液稀释10 倍,在595 nm波长处测定吸光度,以未加蛋白溶液的磷酸盐缓冲溶液作为对照组。表面疏水性以溴酚蓝结合量表示,公式如下:

1.3.4 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDSPAGE)测定

参考Xiong等[12]的方法并加以修改。将制备好的肌原纤维蛋白溶液调整质量浓度为2 mg/mL,采用12%的浓缩胶,4%的分离胶,以体积比1∶1将蛋白液添加上样缓冲液,通过添加和不添加5%的β-巯基乙醇进行SDS-PAGE分析,以对比氧化体系中,不同添加量槲皮素对肌原纤维蛋白的交联和降解情况。运用Quantity One软件进行扫描和分析。

1.3.5 溶解度的测定

参照Joo等[13]的方法并略加修改。用20 mmol pH 7.0的磷酸缓冲溶液配成10 mg/mL的蛋白质溶液,每管取3 mL于10 mL离心管中,4 ℃放置2 h后,10 000 r/min冷冻离心20 min。取上清液1 mL,采用双缩脲法测定蛋白质的浓度。溶解度按照下式计算:

1.3.6 低场核磁共振

采用Bertram等[14]方法,并做适当修改。将测试之前室温放置30 min的凝胶放入直径15 mm核磁管,随后放入分析仪中。测试条件:质子共振频率为22 MHz,测量温度为32 ℃。首先确定测试参数为重复扫描8 次,重复间隔时间为12 500 ms,采样间隔80 μs/样,回波个数18 000。

1.3.7 动态流变学测定

用Discovery DHR-1流变仪测定样品的动态学特性。首先将制备好的蛋白质溶液均匀涂布于测试平台,赶走气泡。测试参数为频率0.1 Hz,应变力2%,上下夹缝1 mm,起始温度30 ℃,升温速率1 ℃/min,终止温度80 ℃。测定过程中,平板外蛋白与空气接触,使用保护盖进行密封。每组3 个重复。测定指标为流变的弹性模量G′和损失模量G″。

1.3.8 凝胶强度的测定

采用TA-XT plus型质构分析仪测定。参数如下:测定模式选择下压距离,测试前速率5 mm/s,测试速率2 mm/s,测试后速率2 mm/s,下压距离为凝胶高度的4 mm,引发力为5 g,探头型号选择P/0.5。将待测样品固定于测定平台好,在室温下进行测定。

1.3.9 凝胶保水性的测定

采用Salvador等[15]的方法测定凝胶保水性,并做适当修改。准确称取离心管的质量,记为m0,取一定质量凝胶(5~8 g)放入离心管底部,准确称取此时离心管的质量,记为m1。在4 ℃、3 000 r/min离心10 min,离心后小心用中性滤纸吸干离心管中凝胶析出的水分,再次准确称取离心管质量,记为m2。每组样品进行3 次平行实验,取平均值。计算公式如下:

1.3.10 微观结构

将肌原纤维蛋白凝胶样品切成2 mm×5 mm的小条,用2.5%的戊二醛溶液(pH 6.8)浸泡,过夜固定。用0.1 mol/L pH 6.8的磷酸缓冲液洗3 次,每次10 min。随后分别用50%、70%、80%、90%的乙醇溶液脱水,每次10 min,再用100%的乙醇脱水,每次10 min,共3 次。最后,采用氯仿脱脂1 h,再用100%乙醇-叔丁醇(1∶1,V/V)以及叔丁醇各进行一次置换,每次为15 min。样品进行冷冻干燥。凝胶样品紧贴在扫描电镜样品台上并且将样品表面喷金,处理好样品后,放入扫描电镜样品盒中待检,加速电压3.0 kV、放大倍数100 000进行观察。

1.4 统计分析

2 结果与分析

2.1 槲皮素对肌原纤维蛋白巯基含量的影响

图1 槲皮素对肌原纤维蛋白巯基含量的影响Fig.1 Effect of quercetin on total SH content of myofibrillar protein

从图1可以看出,氧化(0 μmol/g)后肌原纤维蛋白的巯基含量略有降低,但差异不显著(P>0.05)。添加槲皮素后,巯基含量急剧降低,显著低于2 个对照组(P<0.05),这是由于酚类物质被氧化形成醌,然后醌与肌原纤维蛋白巯基发生共价加成生成巯基-醌加成产物[4,16],从而导致巯基含量降低。Jongberg等[17]将白葡萄提取物加入到肉糜中时,也发现巯基损失的程度增加。从图1还可以看出,槲皮素添加量增加,巯基含量先降低后升高,可能是因为多余的槲皮素会掩盖巯基结合位点,阻碍蛋白质之间形成二硫键,或者阻碍多酚与蛋白质的结合,从而导致总巯基损失的减少。此外,还可能是因为槲皮素结构中的3-OH结构通过电子共轭和错位形成稳定的平面立体结构,从而抑制自由基的生成,防止巯基的损失[18]。Procházková等[19]证实槲皮素的抗氧化活性取决于其2,3-双键和4-羰基结合Fe2+的螯合作用,阻碍其对蛋白质结构的攻击。

2.2 槲皮素对肌原纤维蛋白表面疏水性的影响

图2 槲皮素对肌原纤维蛋白表面疏水性的影响Fig . 2 Effect of quercetin on surface hydrophobicity of myofibrillar protein

疏水相互作用是一种非共价键相互作用,能够说明蛋白质内部疏水基团暴露的程度,从而反映蛋白质构象的变化[20]。从图2可以看出,氧化(0 μmol/g)后蛋白质的表面疏水性略有增加(P>0.05)。10 μmol/g槲皮素使表面疏水性降低(P>0.05),可能是由于蛋白质分子之间发生聚集或蛋白质与槲皮素之间相互作用(如生成巯基-醌加成产物),形成聚合物,从而阻碍了蛋白质结构的展开,疏水性氨基酸埋藏于蛋白质结构内部,导致表面疏水性下降[21-22]。槲皮素添加量增加,蛋白质的表面疏水性均高于10 μmol/g处理组的(P>0.05)。表面疏水性适度增加能够促进热诱导凝胶过程中的疏水相互作用[23],并且表面疏水性增加,说明蛋白质结构展开,因此,更多的活性基团能够参与到凝胶的形成过程中,促进蛋白质分子之间以及蛋白质与槲皮素之间的共价或非共价交联,从而有利于凝胶网络结构的形成。有研究表明,向肌原纤维蛋白中添加中、低浓度的绿原酸,表面疏水性适度增加,同时凝胶强度也提高,但高浓度绿原酸导致表面疏水性显著增加,凝胶强度急剧下降[4]。

2.3 槲皮素对肌原纤维蛋白SDS-PAGE的影响

从图3A可以看出,与两个对照组相比,加入槲皮素后,肌球蛋白重链(myosin heavy chain,MHC)的强度明显减弱,尤其是槲皮素添加量为150 μmol/g时,MHC条带强度更浅,但此时在凝胶顶部并未出现聚集条带,可能是由于巯基-醌共价交联产物的形成导致蛋白质之间或蛋白质与槲皮素之间形成了大分子聚合物,因分子质量较大而未能进入凝胶。槲皮素添加量较低(0、10 μmol/g和50 μmol/g)时,肌动蛋白几乎没有损失,当槲皮素添加量偏高(100 μmol/g和150 μmol/g)时,肌动蛋白条带强度降低,说明肌动蛋白也参与了大分子物质的形成。从图3B可见,添加β-巯基乙醇后,氧化蛋白(0 μmol/g)的MHC和肌动蛋白条带强度增强,说明聚合物通过二硫键形成[5]。与相应未加β-巯基乙醇的肌原纤维蛋白相比,添加β-巯基乙醇后,槲皮素组蛋白MHC和肌动蛋白条带强度增大,且在凝胶顶部出现条带,说明所形成的大分子聚集体可以被还原。

图 3槲皮素对肌原纤维蛋白SDS-PAGE的影响Fig.3 Effect of quercetin on SDS-PAGE pattern of myofibrillar protein

2.4 槲皮素对肌原纤维蛋白凝胶强度、保水性和微观结构的影响

凝胶强度和保水性是反映肌原纤维蛋白凝胶特性的重要指标[24]。从图4A可以看出,未氧化蛋白的凝胶强度高于氧化组(0 μmol/g)(P<0.05),说明氧化破坏了蛋白质结构,蛋白形成凝胶的能力降低。加入槲皮素后,随着添加量的增加,凝胶强度也逐渐增加(P<0.05)。有研究证实,150 μmol/g的绿原酸或没食子酸使肌原纤维蛋白的凝胶强度降低[4-5],而本研究中,槲皮素有利于改善蛋白的凝胶特性,尤其是高添加量(150 μmol/g)时仍能提高蛋白的凝胶强度。Benjakul等[23]报道疏水相互作用增加以及二硫键的形成使得蛋白质有更高的聚合程度,从而形成较好的三维凝胶网络结构。因此,如前所述,可能是由于槲皮素所导致的适度增加的表面疏水性促进了蛋白凝胶网络结构的形成。此外,一般认为,巯基-醌共价交联产物的形成阻碍蛋白质之间形成二硫键,因此不利于凝胶特性,但从本研究来看,凝胶强度并没有降低,反而提高,可能是因为巯基-醌之间的共价交联导致了形成大分子聚集物,槲皮素增加了蛋白质之间的交联聚集程度,因而有利于凝胶的形成。与未氧化的蛋白相比,氧化(0 μmol/g)蛋白的保水性略有降低(图4B),加入槲皮素以后保水性逐渐增加,表明槲皮素可促进蛋白凝胶网络结构的形成,提高蛋白束缚水的能力,这与凝胶强度的结果一致。

蛋白凝胶的微观结构也可说明凝胶强度和保水性的变化。如图4C所示,未氧化的蛋白具有连续、紧密的凝胶网络结构,氧化后凝胶孔隙变大,因此,蛋白凝胶束缚、截流水的能力降低,保水性下降。加入槲皮素后,凝胶孔隙变小,凝胶表面更加光滑、均匀,网状结构更加致密,因此,凝胶强度和保水性提高。

图4 槲皮素对肌原纤维蛋白凝胶强度(A)、保水性(B)和微观结构(C)的影响Fig.4 Effect of quercetin on strength (A), water-holding capacity (B)and microstructure (C) of myofibrillar protein gel

2.5 槲皮素对肌原纤维蛋白流变特性的影响

G′表示凝胶的弹性特征。如图5所示,加热初始阶段,G′增加,这是由于肌球蛋白上重酶解肌球蛋白开始变性,肌球蛋白长丝进行交联引起的;45~50 ℃时,G′下降是由于酶解肌球蛋白轻链开始变性,其尾部解螺旋,破坏了原来的蛋白网络结构[25];之后G′上升,因为此时蛋白质分子已经全部展开,蛋白质之间交联形成了稳定的凝胶网络结构。

图5 槲皮素对肌原纤维蛋白流变特性的影响Fig.5 Effect of quercetin on rheological properties of myofibrillar protein gel

从图5还可以看出,温度在30~50 ℃时,即凝胶形成的初始阶段,加入槲皮素后,蛋白质的G′高于两个对照组,说明槲皮素提高了蛋白质的稳定性,有利于凝胶网络结构的形成。在凝胶形成的最终阶段,加入槲皮素的蛋白凝胶的G′仍较高,说明槲皮素促进了更具弹性的蛋白凝胶网络结构的形成。Yan Mingyan等[26]证实了槲皮素的C6—C3—C6类黄酮类结构与蛋白质互相作用有利于形成稳定的凝胶网络结构,从而增强蛋白凝胶强度和保水性,这与本研究结果相似。槲皮素添加量为150 μmol/g时,最终G′略有降低,可能是槲皮素添加量过高,掩盖了蛋白质功能基团的结合位点,阻碍了蛋白之间的交联,因此降低了G′。G″表示凝胶的黏性特征,其变化趋势与G′相似,加入槲皮素后,蛋白凝胶的G″均高于对照组,这与G′的结果一致。整个加热过程中,G′始终高于G″,尤其是当温度大于50 ℃时,这表明形成了一个更具弹性的蛋白凝胶。

2.6 槲皮素对肌原纤维蛋白水合特性的影响

肌原纤维蛋白凝胶低场核磁衰减曲线拟合的弛豫时间T2分布为4 个峰,其中T2b(0~10 ms)表示结合水;T21(10~100 ms)和T22(100~1 000 ms)表示不易流动水;T23(>1 000 ms)表示自由水。弛豫时间能体现出水分的自由度,弛豫时间长说明水分流动性强,弛豫时间短说明水分流动性弱[27-28]。

表1 槲皮素对肌原纤维蛋白凝胶T2弛豫时间和弛豫峰比例P2的影响Table 1 Effect of quercetin on relaxation time T2 and peak area proportion P2 in myofibrillar protein gel

从表1可以看出,氧化后的蛋白T21、T22变化均不明显,T23略有升高(P>0.05),说明氧化导致凝胶束缚自由水的能力降低,自由水的流动性增加。当加入50、100 μmol/g和150 μmol/g槲皮素后,与氧化组相比,T23降低,说明槲皮素增强了蛋白质截留自由水的能力,使自由水流动性变差,这与本实验凝胶保水性的结果一致。弛豫峰比例P2的变化可以反映不同状态下水分群的相对含量,从而可以评估不同状态下水分群的迁移情况[29]。从表1可以看出,不易流动水(P21和P22)和自由水(P23)所占比例较大,对两种水分的比较分析可知,氧化后,不易流动水的峰面积比例降低,自由水的峰面积比例增加。加入槲皮素后,与氧化组相比,不易流动水的峰面积比例上升,自由水的峰面积比例下降,表明部分自由水转化为不易流动水,进一步证实了槲皮素促进了肌原纤维蛋白凝胶网络结构的形成,增加了对水分的束缚能力[30]。

3 结 论

槲皮素降低了肌原纤维蛋白的巯基含量;中、高添加量的槲皮素(50、100、150 μmol/g)使肌原纤维蛋白的表面疏水性略有提高,因而促进热诱导凝胶形成过程中蛋白质之间的疏水相互作用;槲皮素使MHC条带强度减弱,添加量为100 μmol/g和150 μmol/g时,肌动蛋白条带也减弱,说明MHC和肌动蛋白均参与了肌原纤维蛋白与槲皮素共价交联产物的形成,且交联产物大部分可被还原;槲皮素提高了肌原纤维蛋白凝胶强度和保水性,凝胶微观结构更加致密,部分自由水转变为不易流动水,凝胶对自由水的束缚能力增强;槲皮素提高了肌原纤维蛋白的G′和G″,最终形成了一个更具弹性的凝胶网络结构。因此,槲皮素通过与肌原纤维蛋白巯基的共价交联及适度提高蛋白的表面疏水性改善蛋白的凝胶特性。

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