高效液相色谱法测定香铃草子中还原型谷胱甘肽和总巯基含量

翟方圆， 张小勇， 崔胜云

(延边大学,长白山生物资源与功能分子教育部重点实验室,吉林延吉13302)

香铃草(HibiscustrionumL.) 俗称野西瓜苗，属锦葵科木槿属一年生草本植物。香铃草全草具有清热解毒、祛风除湿、止咳、利尿之功效，主治急性风湿性关节炎；外用治疗烧伤、烫伤、疮毒等症；种子味辛、性平，主治肺结核、肾虚头晕、耳聋耳鸣[1]。生物体内含半胱氨酸残基的巯基肽及蛋白质扮演提高机体免疫、抗氧化、重金属解毒、促氨基酸吸收和细胞信号传导等重要生物活性功能，因此药用植物中的巯基(-SH)化合物是构成其活性功能的重要的成分之一[2 - 5]。目前，植物样品中还原型谷胱甘肽(GSH)等含半胱氨酸残基的巯基化合物的测定大多采用光谱法、色谱法等分析方法。但光谱法受植物色素等干扰较大，而色谱法衍生化试剂较昂贵且前处理不当导致巯基的氧化变性使得测定结果偏低。

本文采用5,5′-二硫双-2-硝基苯甲酸(DTNB)为衍生化试剂，用细胞破壁、衍生化为一体的前处理方法，通过高效液相色谱(HPLC)法，测定衍生化试剂与半胱氨酸残基的巯基发生二硫键交换反应，定量释放出2-硝基-4-巯基苯甲酸(NTB)和小分子巯基化合物衍生化产物复合物的方法，同时测定香铃草子中的小分子巯基化合物和包括巯基蛋白在内的总巯基含量。本研究为香铃草子生物学功能及选择性分析生物样品中巯基化合物的研究提供可靠的实验数据。

1 实验部分

1.1 仪器与设备

HP1100高效液相色谱仪(美国，安捷伦公司)，附二极管阵列检测器；SCIENT-IID型超声波细胞破碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；KQ-500DE型数控超声波清洗器(江苏昆山超声仪器有限公司)； pHS-3C型酸度计(上海精密仪器有限公司)；Mini-10K型离心机(珠海黑白医学仪器有限公司)；SZ-97型全自动三重纯水蒸馏器(上海亚荣公司)。

1.2 试剂与材料

5,5′-二硫双-2-硝基苯甲酸(DTNB)(国药试剂)；还原型谷胱甘肽(GSH，国药试剂)；半胱氨酸(99%，Aldrich)；乙腈(色谱纯，Fisher)；甲酸(98%，色谱纯，国药试剂)；三乙胺(天津市光复化工精细研究所)；其它试剂均为分析纯。实验用水为三次蒸馏水。

香铃草子(秋季本地野外采集)。

1.3 样品处理

取香铃草子干品，用研钵磨成粉末。称取粉末样品2.0 g，加入含过量DTNB(5.0×10-3mol/L)的磷酸盐缓冲溶液(PBS)20 mL，利用超声细胞破壁仪超声破壁5 min、超声波清洗仪超声30 min，离心，抽取上清液，加入2倍体积的乙醇，静置30 min，抽滤，然后以8 000 r/min离心10 min，除蛋白、取上清液作为供试品溶液。

1.4 色谱条件

色谱柱：Inertsil ODS-SP柱(150×4.6 mm,5 μm,日本GL science 公司)；流动相：A为含1%甲酸和0.05%三乙胺的水相 ，B为1%甲酸和0.05%三乙胺的乙腈有机相。采用梯度洗脱程序：14%B(10 min)→28%B(15 min)→90%B(40 min) →90%B(45min)→10%B(50 min),流速为0.8 mL/min；柱温25 ℃；进样量10 μL；紫外检测器的检测波长为327 nm。

2 结果与讨论

2.1 方法原理

衍生化试剂DTNB在PBS(pH=7)中与含半胱氨酸残基的小分子巯基化合物(RSH)，及含巯基蛋白质(Prot-SH)发生定量衍生化反应，并释放出1-硫-5-硝基苯甲酸(TNB)和巯基化合物与TNB的复合物(RS-TNB，Prot-S-TNB)，反应如下：

过量DTNB与样品中含巯基蛋白质(Prot-SH)和小分子巯基化合物(RSH)发生二硫键的交换反应，并分别生成衍生化产物Prot-S-TNB和RS-TNB并定量释放出TNB。由于蛋白质衍生化产物(Prot-S-TNB)可通过除蛋白分离掉，分析溶液中的RS-TNB和TNB分别提供小分子巯基化合物和总巯基含量信息。借此，利用HPLC法分别测定GSH等小分子巯基化合物和总巯基含量。

2.2 色谱条件的优化

巯基化合物衍生化反应定量释放的TNB提供总-SH含量信息。但用紫外检测器同时测定RS-TNB和TNB，因其两者的光谱特性的不同，在选定的检测波长(327 nm)条件下，TNB色谱峰严重拖尾导致无法定量测定总巯基含量。拖尾的原因可能为洗脱过程中TNB与其还原态2-硝基-4-巯基苯甲酸(NTB)相互转换所致，如图1。

TNB 在λmax=412 nm的可见光区有较强的吸收，是目前利用光度法测定GSH等巯基化合物的主要衍生化产物形态。而在酸性条件下，其还原态NTB在所设色谱检测波长(λ=327 nm)处具有强吸收。因此利用所选检测波长下同时得到所有衍生化产物的灵敏、无拖尾的色谱峰，须把TNB转换成光谱特性与其他衍生化产物相匹配的还原态NTB。实验结果表明；通过流动相中加入甲酸使TNB充分转换成NTB的形态，同时在流动相中加入三乙胺来调节洗脱能力，可有效消除拖尾和谱峰不对称及保留值的位移等现象。

2.3 香铃草子中GSH和总巯基测定

2.3.1香铃草子提取液及GSH和半胱氨酸(Cys)衍生产物的对照测定分别用过量DTNB(5.0×10-3mol/L)同步衍生化香铃草子提取液，DTNB与小分子巯基化合物GSH和Cys标准混合溶液进行了HPLC对照测定，结果见图2。如图2所示，在过量DTNB与GSH和Cys标准混合溶液中，分别观察到衍生化产物GS-TNB、Cys-TNB、NTB及剩余的DTNB的色谱峰。在香铃草子提取液中只观察到GS-TNB及NTB及DTNB的色谱峰而观察不到Cys-TNB的色谱峰，说明样品中小分子巯基化合物主要是GSH。

2.3.2校正曲线和样品测定由于DTNB与含半胱氨酸残基的蛋白质，及小分子巯基化合物中巯基的二硫键交换反应无选择性，同时GSH的衍生化产物(GS-TNB)及NTB的色谱峰面积与GSH浓度均呈良好线性关系，因此可用GSH标准溶液校正曲线法测定样品中的GSH和总巯基含量，通过总巯基和GSH含量之差得出样品中蛋白巯基的含量。校正曲线制作过程为；用新配制的含过量DTNB(1.0×10-2mol/L)衍生化试剂的PBS分别配制一系列GSH浓度的标准系列溶液，分别在优化的HPLC条件下测定。结果表明；三次平行测定的衍生化产物GS-TNB和NTB的色谱峰面积(A)与GSH浓度(c)间呈良好的线性关系，其线性回归方程分别为:A=15.9722+20.81457c,A=-49.145+33.258c，相关系数R2均为0.9999。利用校正法测定了香铃草子中的GSH与总巯基及蛋白巯基的含量，结果见表1。

表1 香铃草子中GSH、总巯基及巯基蛋白(Prot-SH)含量

2.4 回收率和检测限

采用回收率试验进一步验证了方法的准确度。分别取一定量的香铃草子提取液，然后分别加入一定浓度的不同量的GSH标准溶液，根据测定的GSH和总巯基的色谱测定结果分别计算加标回收率。检测限是利用公式：YE=μ+ks。式中，YE为可被检测出的最小分析信号值，μ指空白的平均信号值，s为空白测定的标准偏差，k是与置信度有关的整数，这里取k=3。然后分别利用校正曲线的线性回归方程分别计算出GSH和巯基测定的检测限。测定结果见表2。GSH 测定的回收率均值为100.43%，检测限为5.31 μmol/L ，总巯基测定的回收率均值为101.79%，检测限为6.18 μmol/L，满足本测定的准确度和灵敏度要求。

表2 方法的回收率和检测限

3 结论

建立了HPLC同时测定香铃草子中GSH和总巯基含量的方法。采用细胞破壁、同步衍生化的前处理方法，有效阻止巯基在前处理过程中氧化变性，避免巯基氧化变性导致的灵敏度降低及漏检，为准确测定生物样品中活性巯基化合物的测定提供了方法学依据。香铃草子中GSH含量为4.07 μmol/g，总巯基含量为6.06 μmol/g，总巯基含量与GSH含量差值1.99μmol/L为香铃草子含巯基蛋白含量，说明香铃草子是富含GSH及含巯基活性蛋白质的物种。