重组酶聚合酶扩增检测产志贺毒素大肠埃希菌的微流控芯片技术

范一灵，王淑娟，李琼琼，胡 颖，宋明辉，秦 峰,4，刘 浩，杨美成,*

（1.国家药品监督管理局药品微生物检测技术重点实验室，上海市食品药品检验研究院，上海 201203；2.中国食品药品检定研究院，北京 102629；3.遵义医科大学公共卫生学院，贵州 遵义 563006；4.复旦大学化学系，生物医学研究院，上海 200438）

产志贺毒素大肠埃希菌（Shiga toxin-producingEscherichia coli，STEC）是一类可引起人类腹泻、肠出血、溶血性尿毒综合征、肾衰竭、溶血性贫血以及死亡的食源性致病微生物[1]，可存在于水体、植物、动物尤其是反刍动物体内[2]。食品中低于100 CFU的STEC菌体就可能导致人类患病[3]。STEC共有超400 种血清型[4]，在非O157:H7血清型的产志贺毒素大肠埃希菌（Non-O157 STEC）中，有6 种被认为是检出率最高、危害较大的菌株，分别是O26（22%）、O111（16%）、O103（12%）、O121（8%）、O45（7%）和O145（5%）[5-6]。美国疾控中心发布的数据显示，2016年美国有5 441 例经确认的STEC感染事件[7]，预估有超过26万 名患者，导致30 人死亡[8]。

目前，检测STEC的主要分子靶点是编码志贺毒素的stx基因。该基因主要分为stx1和stx2基因两类[9-10]。其中，stx1基因有3 个亚型，分别为stx1a、stx1c、stx1d；而stx2基因的亚型较多，常见的亚型有stx2a到stx2g共7 种亚型[9,11]。国际上主要采用实时聚合酶链式反应（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）[12-14]对其进行检测，其中使用较广的国际标准化组织（International Organization for Standardization，ISO）和美国农业部（United States Department of Agriculture，USDA）方法也采用该技术对疑似含STEC的增菌培养物进行初筛[15-16]。然而，real-time PCR方法需要温度在50～100 ℃间不停变化，对相关检测设备要求较高，无法便携携带，较难满足基层实验室和现场快速检测的需求。

近年来，以恒温方式扩增目标核酸的方法被逐步应用于微生物检测领域，给致病菌的核酸快速检测提供了更多选择。如环介导等温扩增技术[17]、基于核酸序列的扩增技术、解旋酶依赖等温扩增技术、重组酶聚合酶扩增技术（recombinase polymerase amplification，RPA）和滚环扩增技术等[18-19]。其中，RPA技术可在较低温度（38～42 ℃）扩增目标核酸，反应过程中无需高温解开DNA双链，引物设计相对简单，扩增速度快、准确度高[20]，对设备要求低，可用于现场检测[21]。微流控芯片技术是在特殊材质的芯片上使用微米甚至纳米级微管道将样品制备、分散和检测等步骤进行集成的技术[22]。因其具有微型化、集成化的特点，适用于微量的分子检测，可提高检测效率，节省试剂成本[23-24]。离心式微流控芯片借助离心力将芯片中的液体经微孔道分散达到检测目的，摆脱了传统微流控芯片对加样器和压力泵的限制，操作简单，容易实现高通量和便携式检测[25-26]。

本研究通过对stx基因亚型序列的分析，设计检测STEC的荧光RPA引物与探针组合，以集成化圆盘式微流控芯片为载体，开发特异性的检测方法。通过考察方法的包容性、排他性、灵敏度和准确性等指标，实现对食品中STEC菌株的高通量、快速筛查和检测。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株

实验所用测试菌株共40 株（表1）。其中，15 株Non-O157 STEC和1 株E. coliO157:H7菌株来自中国食品药品检定研究院（标注为FC和ST编号菌株），采用Scheutz等[11]方法对stx基因进行分型确认；3 株E. coliO157:H7标准菌株、7 株普通E. coli标准菌株和14 株其他微生物菌种由上海市食品药品检验研究院提供。14 株其他微生物菌种包括：铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosaCMCC 10104）、乙型副伤寒沙门菌（Salmonella paratyphiB CMCC 50094）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilisCMCC 63501）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureusATCC 6538）、福氏志贺氏菌（Shigella flexneriCMCC 51572）、阪崎肠杆菌（Enterobacter sakazaliiATCC 29544）、神户肠杆菌（E. kobei）、液化沙雷氏菌（Serratia liquefasciens）、豪氏变形杆菌（Proteus hauseri）、蜂房哈夫尼亚菌（Hafnia alvei）、摩氏摩根氏菌（Morganella morganii）、普通变形杆菌（Proteus vulgari）、弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii）和布氏柠檬酸杆菌（C. braakii）各1 株，非标准菌株分离于市售牛肉样品。

1.1.2 试剂

胰酪大豆胨液体（tryptic soy broth，TSB）培养基德国Merck公司；细菌基因组提取试剂盒 德国QIAGEN公司；基础型DNA恒温快速扩增试剂盒、荧光型DNA恒温快速扩增试剂盒 安普未来生物科技有限公司；柱式PCR产物纯化试剂盒 生工生物工程（上海）股份有限公司；GelRed核酸染色液 美国Biotium公司；DL2000 DNA Marker、PCR预混液 宝日医生物技术（北京）有限公司。

1.2 仪器与设备

VITEC 2 Compact全自动生化鉴定仪 法国生物梅里埃公司；BioPhotometer Plus核酸蛋白定量检测仪德国Eppendorf公司；VERITI PCR扩增仪 美国Applied Biosystems公司；GelDoc XR紫外成像仪 美国Bio-Rad公司；480II荧光定量PCR仪 罗氏诊断产品（上海）有限公司；SX-MA2000 plus芯片检测仪 上海速芯生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌种复苏与核酸的提取

将微生物菌种接种于TSB培养基中，置（36±1）℃过夜培养。采用生化鉴定仪确认。取TSB增菌培养物1 mL至离心管中，选用细菌基因组提取试剂盒，按说明书操作，最后将提取的基因组核酸溶解于三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸缓冲液（tris-EDTA buffer solution，TE）缓冲液100 μL，置-20 ℃保存。用核酸蛋白定量检测仪测定核酸浓度。

表1 实验所用菌株及stx基因的real-time PCR和荧光RPA检测结果Table 1 Bacterial strains used in this study and results of detection of their stx genes using real-time PCR and fluorescence RPA

续表1

1.3.2 引物和探针的设计及核酸扩增

从GeneBank数据库（www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank）中获得stx1和stx2基因亚型的核酸序列，包含stx1基因亚型3 种（stx1a、stx1c、stx1d）和stx2基因亚型7 种（stx2a、stx2b、stx2c、stx2d、stx2e、stx2f、stx2g）。将上述序列采用MEGA X软件进行比对，寻找相对保守区域，根据序列比对信息，标出简并碱基。采用Primer Premier 5.0软件按TwistDx公司RPA设计原则分别设计上下游引物和探针（表2）。其中，引物长度一般在25～35 bp，GC含量在30%～70%之间。探针序列不与引物识别位点重叠，长度一般为46～52 bp。引物和探针序列要避免出现回文结构、内部二级结构和连续重复碱基。此外，核酸扩增片段也应尽量避免形成二级结构，扩增片段长度一般在150～300 bp之间。引物和探针由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

普通RPA反应选用基础型DNA恒温快速扩增试剂盒。在干粉反应管中加入29.4 μL反应预混液A，上下游引物（10 μmol/L）各2 μL，DNA模板1.5 μL，加水至47.5 μL，最后加入缓冲液B（含280 mmol/L醋酸镁溶液）2.5 μL配成50 μL反应体系。stx1和stx2基因的检测反应体系均分别独立配制。充分混匀，置于PCR仪中39 ℃恒温反应20 min。用柱式PCR产物纯化试剂盒纯化扩增产物。取5 μL已纯化产物经质量分数为1.5%的琼脂糖凝胶电泳，用GelRed溶液10 μg/mL浸泡染色10 min，置紫外成像仪内观察。实验中在独立的实验区域进行产物纯化和电泳，防止扩增产物气溶胶的污染。

荧光RPA反应选用荧光型DNA恒温快速扩增试剂盒。在干粉反应管中加入29.5 μL反应预混液A，制成完整预混液A。取2.95 μL完整预混液A，上下游引物和探针（10 μmol/L）各0.1 μL，DNA模板1.5 μL，最后加入缓冲液B（含280 mmol/L醋酸镁溶液）0.25 μL，配成5 μL反应体系。充分混匀，置real-time PCR仪中39 ℃恒温反应20 min，每30 s采集一次荧光信号，共40 个循环。stx1和stx2基因的检测反应体系均分别独立配制。

STEC菌种的stx基因携带情况按美国农业部2021年更新的微生物实验室技术指南5C.01[27]中real-time PCR方法进行验证。反应体系为1×PCR反应预混液，上下游引物各1.25 μmol/L，stx1和stx2基因探针各0.25 μmol/L，DNA模板5 μL，加水配成25 μL反应体系。stx1和stx2基因的检测反应体系均分别独立配制。反应程序为95 ℃加热3 min；95 ℃退火15 s，59 ℃延伸1 min，共40 个循环。

表2 实验所用的引物和探针核酸序列Table 2 Nucleic acid sequences of primers and probes used in this study

1.3.3 RPA检测方法的评价

将检测stx1和stx2基因的备选RPA反应的上下游引物分别进行两两组合，以E. coliCICC 21530基因组核酸为模板，按普通RPA反应条件筛选适宜的RPA扩增引物。选择扩增效率较高，且产物条带单一的引物组合分别与相应探针配对，用表1所列菌种的基因组核酸评价荧光RPA方法的包容性和排他性。将E. coliCICC 21530的基因组核酸进行10 倍梯度稀释，质量浓度分别为1.28×105、1.28×104、1.28×103、1.28×102、1.28×101、1.28、1.28×10-1pg/μL和1.28×10-2pg/μL，将E. coliCICC 21530的TSB新鲜培养物进行10 倍梯度稀释，菌体浓度分别为9.5×107、9.5×106、9.5×105、9.5×104、9.5×103、9.5×102、9.5×101CFU/mL和9.5 CFU/mL，分别用于评价荧光RPA方法的检测灵敏度。

1.3.4 荧光RPA微流控芯片方法的评价

实验所用圆盘离心式微流控芯片组件由聚碳酸酯材料经微注塑工艺成圆盘式结构[28]，每张芯片有8 套相同的微流控结构区，每个结构区分别有1 个加样区、1 个液体分配区和4 个独立反应区，可同时进行32 个反应。将完整反应预混液A、上下游引物和探针按5 μL荧光RPA反应体系预先加入芯片反应区中，每个结构区中对stx1和stx2基因分别做2 个重复测试，风干约15 min后用塑封膜密封，储存于-20 ℃保存备用。测试时，每个加样区按4 个5 μL荧光RPA反应液的反应体系，将核酸模板与缓冲液B 1 μL混合，加水使混合液体积为20 μL。将待测混合液加入芯片中，经1 500 r/min离心使液体进入分配区，被定量分成4等份，再将芯片经4 500 r/min离心使液体进入反应区，在芯片检测仪内维持39 ℃孵育30 min，每30 s检测一次荧光信号。将E. coliCICC 21530的基因组核酸及其新鲜培养的菌体分别进行10 倍梯度稀释，用以评价荧光RPA微流控芯片方法的检测灵敏度。

1.3.5 人工污染样品检测

取市售牛肉馅样品，混匀后分成25 份，每份约25 g。随机取1 份作对照，其余样品分为3 组，分别加入E. coliCICC 21530的菌悬液，由于计数结果的随机性，每组样品的接种量分别约为10、1 CFU/25 g和小于1 CFU/25 g。按照GB 4789.6—2016《食品微生物学检验 致泻大肠埃希氏菌检验》的方法进行增菌培养。分别取肠道增菌肉汤培养物1 mL，室温、500 r/min离心1 min；取上清液至新的无菌离心管中，室温、10 000 r/min离心5 min；弃去上清液，加入500 μL生理盐水，重悬，室温、10 000 r/min离心3 min；弃去上清液，加入TE缓冲液100 μL，重悬；99 ℃加热15 min，置室温冷却2 min，室温、13 000 r/min离心4 min；取上清液即为样品基因组核酸溶液。剩余的肉汤培养物按国标方法检测。将国标方法与荧光RPA微流控芯片方法的检测结果按ISO 16140-2: 2016中替代方法评价的方式，计算方法的相对正确度和相对检出水平。

2 结果与分析

2.1 菌株stx基因型的确认

采用USDA公布的real-time PCR方法对实验所用菌种stx1和stx2基因进行确认（表2）。real-time PCR对STEC菌株的检测结果与已知的菌种信息一致，其他非STEC菌种的检测结果均为阴性。待测菌种可用于后续方法的评价过程。

2.2 普通RPA扩增引物的筛选

以MEGA X软件分析stx1和stx2基因序列，在目标基因序列中确定上下游引物的结合位点，预测扩增产物大小（表3）。比较普通RPA反应的扩增产物电泳条带大小与预测产物长度大小，结合RPA终产物浓度的高低（即电泳条带明亮度），选择stx1-F1与stx1-R1引物组合用于检测stx1基因（图1A），选用stx2-F2与stx2-R2引物组合用于检测stx2基因（图1B）。

表3 不同引物组合预测的普通RPA反应扩增产物大小Table 3 Predicted sizes of conventional RPA-amplified products using different primer combinations bp

图1 不同引物组合的普通RPA反应产物电泳图Fig.1 Electrophoregrams of conventional RPA products of stx gene using different primer combinations

2.3 荧光RPA方法的包容性和排他性

采用荧光RPA方法检测试验菌株基因组核酸，目标菌stx1和stx2基因的判断与菌种确认的基因信息一致，非目标菌基因组核酸测试结果均为阴性（表1）。荧光RPA方法可在7 种常见的STEC血清型（O157、O26、O45、O103、O111、O145、O121）中有效检测9 种stx基因亚型，分别为stx1a、stx1c、stx1d、stx2a、stx2b、stx2c、stx2d、stx2e和stx2g基因，方法包容性和排他性均为100%。

2.4 荧光RPA方法的灵敏度

如图2所示，在20 min内分别以引物stx1-F1与stx1-R1组合（图2a）和引物stx2-F2与stx2-R2组合（图2b）检测STEC基因组核酸的灵敏度均为12.8 pg/μL。

图2 荧光RPA检测E. coli CICC 21530基因组核酸灵敏度实验Fig.2 Sensitivity of fluorescence RPA method for detecting genomic nucleic acid in E. coli CICC 21530

对E. coliCICC 21530的TSB培养物进行10 倍梯度系列稀释，用以考察荧光RPA方法检测菌体细胞的灵敏度。荧光RPA方法可在20 min内以引物stx1-F1与stx1-R1组合检测STEC菌体的灵敏度为9.5×103CFU/mL（图3a）；虽然引物stx2-F2与stx2-R2组合在9.5×102CFU/mL时检测到阳性扩增信号，但出现信号的循环数偏大，荧光信号与背景信号差异偏小，因此，stx2-F2与stx2-R2引物组合检测STEC菌体的灵敏度为9.5×103CFU/mL（图3b）。

图3 荧光RPA检测E. coli CICC 21530菌体的灵敏度实验Fig.3 Sensitivity of fluorescence RPA method for detecting E. coli CICC 21530 cells

2.5 荧光RPA微流控芯片检测灵敏度

采用圆盘式微流控芯片对E. coliCICC 21530的TSB培养物的10 倍梯度系列稀释液进行检测。引物stx1-F1与stx1-R1组合可检测的菌体灵敏度为9.5×104CFU/mL（图4a）；引物stx2-F2与stx2-R2组合可检测菌体灵敏度为9.5×103CFU/mL（图4b）。在相同核酸上样量的情况下，微流控芯片检测stx1基因的灵敏度有所降低，对stx2基因的检测灵敏度维持不变。但由于微流控芯片体系采用反应体系预置干燥形式，最大可将核酸上样量增加至4.75 μL，可提高检测的灵敏度。

图4 荧光RPA微流控芯片检测E. coli CICC 21530菌体的灵敏度实验Fig.4 Sensitivity of fluorescence RPA-integrating microfluidic chip for detecting E. coli CICC 21530 cells

2.6 人工污染样品检测

采用荧光RPA微流控芯片法（替代方法）和GB 4789.6—2016（参考方法）分别对3 组不同污染程度的24 份人工污染样品和1 份阴性对照样品进行检测，替代方法和参考方法所得检测结果均一致，其中，对污染水平为10 CFU/25 g和1 CFU/25 g的样品检测结果均为阳性；在污染水平低于1 CFU/25 g的样品中，有2 份检测结果为阴性，其余6 份样品检测结果为阳性，该浓度阴性样品占比为25%（2/8）。将检测结果按ISO 16140-2:2016中参考方法和替代方法的实验结果进行汇总（表4）。按ISO 16140标准计算荧光RPA微流控芯片法的相对正确度和相对检出水平均为100%，方法未见假阳性和假阴性结果。

表4 荧光RPA微流控芯片法和GB 4789.6—2016方法的实验结果比较Table 4 Comparison of results for artificially contaminated samples detected by fluorescence RPA-integrating microfluidic chip and national standard method (GB 4789.6-2016)

3 讨论与结论

RPA技术是等温扩增技术之一，由于其反应温度低，无需复杂加热设备，反应时间短，具有良好的灵敏度和特异性[21]，适合与微流控芯片技术结合开发微生物快速检验方法[18-19]。本研究采用两段离心式微流控芯片的管路设计，将反应预混液提前预置在芯片中。与传统检测方法相比，操作者省去了复杂的体系配制，只需一步加样混合，便可同时进行多平行和多靶点测试，反应在镁离子存在的条件下，在39 ℃迅速启动，20 min内实现高通量和便捷化的测试结果。虽然，微流控技术受反应体积和液体残留等影响会略微降低荧光RPA方法的检测灵敏度，但反应体积可由RPA反应标准方法的50 μL减少至5 μL，极大地降低试剂成本的同时，可检测约10～100 CFU/μL的目标微生物。由于芯片中预置体系是脱水状态，加样时可通过增加核酸模板的量提升测试的检测灵敏度。

stx基因是STEC菌株最主要的毒力编码基因，由可高度转移的遗传元件stx噬菌体编码，该噬菌体的基因水平转移，可能导致stx基因在大肠埃希菌中的传播[29]，并导致新基因亚型出现[30]，也是STEC菌株成为日益严重的食品安全问题的原因之一[31]。stx基因的突变和重组现象较普遍[11]，尤其是stx2基因，除stx2a到stx2g亚型外，新的亚型也不断被发现，如stx2h[32]、stx2i[33]和stx2k等[34]。目前，还未见有快速检测方法可以覆盖所有stx基因亚型，USDA[15]和ISO[16]的官方标准检测方法也漏检stx2f基因亚型。stx2f基因在核酸序列上与其他stx2基因序列差异较大[11]，为检测stx2f基因还需额外设计引物和探针。本研究所用方法可检测stx2a至stx2g基因亚型（除stx2f基因外），检测范围与USDA方法相同。虽然，也有研究人员开发了检测STEC的RPA方法[35]，通过MEGA X比较其引物序列，该序列缺少简并碱基，与stx2b、stx2e、stx2f、stx2g等基因亚型无法完全匹配，测试数据缺少可检测基因亚型的确认。

在检测食品样品中，食物基质颗粒物可能会阻塞微流控芯片的微孔道，影响检测结果。为了去除食品基质干扰，在样品基因组核酸提取过程中，先通过低速离心的方式去除较大颗粒物，在加热释放核酸后采用高速离心分离大多数不可溶杂质，减少上样过程中的颗粒干扰。此外，在核酸提取过程中的清洗离心步骤有助于去除大部分的脂肪和蛋白成分，有助于降低其对酶反应效率和荧光信号探测的影响。

本研究结合了荧光RPA技术和离心式微流控芯片技术，以预置的荧光RPA反应体系可简便、快速地检测食品中STEC菌株。该方法特异性高、准确度好，对仪器设备要求低，且具备高通量检测能力。