美味牛肝菌矿质元素富集能力及产地鉴别

陈凤霞，杨天伟，李杰庆，刘鸿高，范茂攀,*，王元忠

（1.云南农业大学资源与环境学院，云南 昆明 650201；2.云南省农业科学院药用植物研究所，云南 昆明 650200；3.云南省热带作物科学研究所，云南 景洪 666100；4.云南农业大学农学与生物技术学院，云南 昆明 650201）

云南地处云贵高原，地形地貌复杂多样，山区面积比例大且高温高湿的气候孕育了丰富的野生菌资源[1]。美味牛肝菌是一种可食用的大型真菌，其肉质鲜美、芳香四溢，具有较高的食用药用价值，广受消费者喜爱[2-3]。菌类中富含多种矿质元素，其富集能力与土壤中矿质元素含量具有相关性[4-6]。矿质元素是维持人体健康的必需营养元素[7]，如Ca是人体所需的基本营养素，99%存在于牙齿和骨骼中[8]；Fe主要用于氧运输，是多种人体代谢的重要物质[9-10]；K和Na协调细胞内外液量平衡，是人体中非常重要的电解质[11]。野生食用菌对矿质元素的富集能力通常高于其他微生物和植物类群，研究美味牛肝菌矿质元素的富集能力，可为消费者合理膳食与野生菌资源开发提供理论依据。

数据融合是将多个不同来源、不同种类的数据信息进行优化重组，分为低、中、高3 种融合方式，主要用于药用植物研究及食品质量评价[12-13]。光谱分析技术作为一种低成本、易操作、简单快捷的新兴技术，常用于野生食用菌品质研究[14-16]。光谱分析结合数据融合策略可以实现不同信息间的优势互补，对多种光谱数据进行整合优化，提高数据的有效性和整体性，在食品种类鉴别、质量评价、产地溯源、掺假等研究中较为广泛。裴艺菲等[17]在重楼产地鉴别研究中采用多光谱数据融合与化学计量学。Wang Ye等[18]融合了近红外和紫外-可见光谱数据鉴定石斛属植物。李秀萍等[19-20]在野生牛肝菌鉴别中使用光谱信息数据融合。Li Yang等[21]利用近红外、中红外光谱结合化学计量学与数据融合对橄榄油掺假问题进行研究。张钰等[22]结合矿质元素与红外光谱对美味牛肝菌进行产地鉴别，结果表明中级融合是一种有效方法。Qi Luming等[2]对美味牛肝菌产地溯源研究中使用了元素数据、多光谱信息进行数据融合。Yao Sen等[23]对牛肝菌进行产地鉴别中使用了傅里叶变换红外光谱学、紫外-可见光谱数据融合与多元统计分析，结果表明，数据融合鉴别效果比单一光谱更佳。

本实验测定了云南6 个产地美味牛肝菌及土壤中的9 种矿质元素含量，结合傅里叶变换近红外光谱与紫外-可见光谱，根据矿质元素富集系数（bioaccumulation factor，BCF）与偏最小二乘判别分析（partial least squares discrimination analysis，PLS-DA）对美味牛肝菌进行矿质元素、富集能力研究，建立准确快速的产地鉴别模型，以期为促进云南高原特色农业产业及合理开发持续利用资源提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

79 份美味牛肝菌样品采自云南6 个不同产地，每个产地均收集子实体附近的土壤样品。详细情况见表1。将采集的土壤样品放置于室内通风处进行风干并去除植物残体及石块，粉碎过100 目筛，使用磨口塞广口瓶保存备用。美味牛肝菌样品采集后，用陶瓷刀刮去表面泥土、杂草、枯叶等杂物并清洗干净，50 ℃至12 h烘干，粉碎过100 目筛至粒度为1 mm后置于自封袋。

表1 不同产地美味牛肝菌样品信息Table 1 Information about B. edulis samples tested in this study

茶叶标准物质（GBW07605） 地矿部物化探研究所；土壤成分分析标准物质（GBW07406）、菠菜标准（GBW10015） 地球物理地球化学勘查研究所；65%硝酸（优级纯）、30%过氧化氢（分析纯）、氯仿（分析纯）、48%氢氟酸（分析纯）、高氯酸（分析纯）、盐酸（优级纯）、9 种矿质元素标准溶液 济南众标科技有限公司。

1.2 仪器与设备

傅里叶变换近红外光谱仪 美国Thermo Fisher公司；ICPE-9000电感耦合等离子体原子发射光谱仪、TU-1901紫外-可见分光光度计 日本岛津公司；Mars6微波消解仪 美国CEM公司；AR1140型万分之一分析天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 美味牛肝菌子实体矿质元素含量测定

用万分之一天平准确称取已烘干打粉后的美味牛肝菌样品（300±0.10）mg，置于消解罐中，加入5 mL硝酸和2 mL过氧化氢，常温消解1 h后放入微波消解仪，消解分为4 步骤，调至升温时间均为5 min、温度在20～110、110～140、140～160、160～180 ℃，维持时间5 min，功率为1 800 kW。消解后冷却定容至25 mL，待测。相同方法制备空白溶液，每个样品重复3 次，取平均值。

1.3.2 土壤矿质元素含量测定

称取（100±0.10）mg土壤样品置于烧杯，加入5 mL硝酸和1 mL高氯酸并进行加热，待出现大量白烟时开始冷却。冷却后加入8 mL氢氟酸和0.5 mL高氯酸继续加热直至白烟消失，加入10 mL盐酸，待完全溶解后定容至25 mL，待测。每个样品重复3 次，取平均值。

1.3.3 标准曲线绘制

用10%硝酸溶液配制成0.00、0.50、1.00、5.00、10.00、20.00 μg/mL的Mn、Cu、Fe、Zn、Mg、K、Na、P、Ca元素标准曲线溶液，建立茶叶标准物元素曲线和土壤标准物元素曲线。

1.3.4 近红外光谱采集

称取（20.00±0.50）g样品混合均匀，置于玻璃器皿进行压缩，用傅里叶变换近红外光谱仪进行扫描，采集范围10 000～4 000 cm-1，分辨率4 cm-1，信号累计扫描64 次，重复3 遍取平均值。

1.3.5 紫外光谱采集

称取（100.00±0.20）mg样品与10 mL氯仿溶剂，摇匀后超声40 min，使用3 层滤纸过滤，提取清液待测。TU-1901紫外-可见分光光度计自检预热1 h后通过空白对照扣除背景值，并采集200～400 cm-1范围的光谱。每个样品扫描3 遍并取平均值。

1.4 数据处理

使用OMNIC8.0光谱处理软件对近红外光谱进行自动基线校正和吸光度转换，UVProbe 2.34紫外光谱处理软件对紫外光谱进行处理，SIMCA13.0对近红外光谱数据进行平滑（Savitzky-Golay，SG）+二阶导数（second derivatives，2D）、SG+标准正态变换（standard normal variables，SNV）；对紫外光谱数据进行多元散射校正（multiple scattering correction，MSC）+2D、SG+2D、SG+MSC、SNV+2D等预处理，将最佳预处理后的数据用Matlab2018a进行Kennard-Stone算法筛选2/3训练集和1/3预测集。通过SIMCA13.0建立PLS-DA单光谱分类模型和数据融合分类模型。

2 结果与分析

2.1 矿质元素的测定

采用茶叶标准物（GBW07605）、菠菜标准物（GBW10015）和土壤成分分析标准物（GBW07406）对方法准确性进行验证。由表2可知，茶叶标准物和土壤标准物与茶叶测定值和土壤测定值接近，其中茶叶中元素回收率在94%～101%之间，部分菠菜中元素回收率在96%～99%之间，土壤中元素回收率在94%～107%之间，表明测定的矿质元素在国家标准范围之内，此方法具有可靠性。

表2 茶叶标准物（GBW07605）、菠菜标准物（GBW10015）和土壤成分分析标准物（GBW07406）的元素测定结果Table 2 Measured mineral element contents of tea standard GBW07605 and spinach standard GBW10015 and soil component analysis standard GBW07406

2.2 矿质元素分析

BCF也称生物富集因子，是植物与土壤中矿质元素含量的比值，用于评价植物对矿质元素的富集能力[24]。表3为6 个产地土壤和美味牛肝菌的9 种元素含量平均值以及美味牛肝菌对土壤中元素的BCF。美味牛肝菌中矿质元素的BCF为子实体中元素含量的平均值除以土壤中同一元素的含量，BCF＞1表明子实体中元素的富集能力较强。表3中，6 个产地土壤中Fe含量最高，来自文山市东山乡的土壤中Fe含量已达到48 323.75 mg/kg，可能与云南富含Fe金属离子的酸性土壤有关。美味牛肝菌中K和P含量最高，范围在10 204.71～13 734.32 mg/kg和4 773.35～6 240.71 mg/kg，表中除了云南省昆明市安宁八街镇Zn的BCF小于1外，5 个产地K、P、Zn的BCF值均大于1，文山市东山乡美味牛肝菌P的BCF值最高，为4.63，结果显示美味K、P、Zn比其他元素更易富集在美味牛肝菌中。如表所示，6 个产地Cu和Na的BCF值基本小于1，来自云南省大理市弥渡和云南省文山市东山乡的美味牛肝菌对土壤中Cu或Na的富集能力较强，BCF＞1。说明不同产地美味牛肝菌对土壤中矿质元素的富集能力有所差异。美味牛肝菌中富含多种人体所需的常量元素与微量元素，K、P、Fe含量最为丰富，在10 204.71～13 734.32、4 773.35～6 240.71、411.93～1 536.50 mg/kg范围之间，其中来自昆明市安宁八街镇与保山市隆阳区的美味牛肝菌样品中P、Fe和K含量最高。其次是Mg、Na、Ca、Zn、Cu、Mn。含量较少的元素为Mn和Cu，范围在23.14～37.24、33.54～43.43 mg/kg之间。云南省文山市东山乡的美味牛肝菌中Na含量是来自云南省昆明市安宁八街镇的美味牛肝菌Na含量的20.70 倍，不同产地美味牛肝菌样品相同元素之间具有差异显著性，可能与不同产地的土壤与生长环境有关。

2.3 光谱分析

图1为6 个产地美味牛肝菌的近红外和紫外平均光谱图，图1a是近红外光谱图，波数范围在4 005～5 388 cm-1和5 780～8 461 cm-1之间有吸收峰，在强吸收峰范围内，4 358 cm-1附近可能为—CH2多糖伸缩振动，4 628～4 981 cm-1范围附近可能与N之间H、C＝O、O之间H有关[22]。6 个产地的美味牛肝菌近红外光谱峰形大致相似，但吸收强度明显且可进行产地区分。图1b为紫外光谱图，根据光谱吸收峰特征，截取200～450 nm范围内的波长，提高紫外数据对产地鉴别的准确性。紫外光谱范围在300～450 nm之间无光谱明显吸收峰，表明样品大致成分相同。强吸收峰范围在255～300 nm之间，具有指纹及化学成分差异，能有效进行产地分类鉴别。

表3 不同产地美味牛肝菌和土壤矿质元素含量及BCFTable 3 Contents and enrichment coefficients of mineral elements in B. edulis and soil from different producing areas

图1 6个产地美味牛肝菌的近红外平均光谱（a）和紫外平均光谱（b）图Fig.1 Near infrared (a) and UV-visible (b) spectra of B. edulis from six producing areas

2.4 光谱预处理结果

表4 近红外光谱与紫外光谱预处理结果Table 4 Pretreatment of near infrared and UV-visible spectra

校正均方根误差（root mean square error of calibration，RMSEC）、交叉验证均方根误差（root mean square error of cross validation，RMSECV）为模型参数，参数值越接近0说明模型效果越好。表4为近红外和紫外光谱的数据预处理PLS-DA结果。选取特征值＞1的主成分个数，表中显示近红外最佳预处理方法为SG+2D，RMSEC与RMSECV分别为0.074 07和0.261 92，训练集正确率为100.00%，预测集正确率为88.46%。紫外最佳预处理方法为SG+MSC，提取5 个主成分，RMSEC与RMSECV为0.261 70和0.275 83。训练集正确率为84.91%，预测集正确率为96.15%。将最佳近红外、紫外光谱预处理结果进行保留，作为建立单一光谱产地分类3D模型的数据。

2.5 美味牛肝菌PLS-DA光谱产地分类

PLS-DA是一种高维数据分析方法。此方法对不同处理样本的特性进行训练，对照其训练集与预测集检验可信度，常结合光谱分析技术用于食品安全检测[25-26]。Yulia等[27]在咖啡掺假研究中使用了紫外光谱与PLS-DA方法，结果显示，此方法能准确、有效的鉴别掺假咖啡。Wang Ye等[28]采用傅里叶红外光谱、矿质元素结合PLS-DA对牛肝菌进行种类与产地分析。李运等[29]在三七产地鉴别溯源研究中使用红外光谱信息结合PLS-DA，为三七质量控制提供方法。图2为6 个产地PLS-DA产地分类3D模型图，由图2a可知，来自云南省保山市隆阳区的美味牛肝菌样品可以很好地聚在一起，其他产地美味牛肝菌样品大致可以进行区分，来自云南省玉溪市易门铜厂的样品聚为两类，云南省昆明市安宁八街镇与云南省文山市东山乡的样品聚成一团，无法进行产地区分。云南省大理市弥渡采集的9 个样品基本聚为一类，云南省迪庆藏族自治州采集的17 个样品基本聚为一类，但个别样品比较零散。由图2b可知，相同产地美味牛肝菌样品不能很好的聚在一起，云南省玉溪市易门铜厂一部分样品聚类在云南省保山市隆阳区，云南省昆明市安宁八街镇样品聚类在其他几个产地，云南省迪庆藏族自治州采集的样品较为分散，部分样品分类错误，云南省大理市弥渡采集的样品基本可以聚在一起，但存在个别聚团分散。表明紫外光谱不能作为理想的产地鉴别数据。图2c为近红外光谱和紫外光谱的低级数据融合，其中提取主成分12 个，RMSEE和RMSECV分别为0.054 621和0.233 757，模型训练集正确率为100.00%，预测集正确率为88.46%，与单一光谱中近红外分类效果相同，由图2c可知，云南省保山市隆阳区的美味牛肝菌样品聚类效果最好，但其他产地聚类效果不佳，其中云南省玉溪市易门铜厂、云南省昆明市安宁八街镇、云南省文山市东山乡分类聚为一团，产地区分不明显。来自云南省迪庆藏族自治州部分样品分类错误。图2d为近红外光谱和紫外光谱的中级数据融合，提取5 个主成分，RMSEE和RMSECV分别为0.199 75和0.291 536，模型训练集正确率100.00%，预测集正确率为92.31%，模型经过HottellingT2检测法进行准确性检验，其中为13.046 1，模型均未超过置信区间，表明模型准确可靠。图2d中6 个产地的不同样品聚类明显，其中3 个产地的样品聚为一类，并与其他产地样品聚团隔离。云南省玉溪市易门铜厂的样品中有少数样品聚类在云南省昆明市安宁八街镇，云南省文山市东山乡和云南省昆明市安宁八街镇样品聚团靠近，但相同产地样品形成聚团。根据图2分析表明，中级数据融合是进行美味牛肝菌产地溯源研究的最佳方法。

图2 PLS-DA的单一光谱与数据融合后的产地分类3D图Fig.2 3D map showing geographical origin classification using monospectral data fusion combined with PLS-DA

3 结 论

本实验采用6 个产地美味牛肝菌及土壤样品，对美味牛肝菌中矿质元素与土壤中矿质元素进行富集规律研究及矿质元素分析，结合近红外光谱和紫外光谱建立PLS-DA的3D模型产地分类图。结果表明，文山市东山乡土壤Fe含量最高，可能与云南高温高湿环境导致的酸性土壤有关；美味牛肝菌中含有大量K和P；6 个产地的Zn、K、P平均BCF为1.05、2.14、3.70，显示土壤中的Zn、K、P元素更易富集在美味牛肝菌内，不同产地美味牛肝菌对土壤中相同元素的富集能力不同；单一光谱中，近红外光谱的产地分类效果比紫外光谱更佳；中级数据融合中模型训练集正确率100%，预测集正确率92.31%，分类效果明显，可以作为美味牛肝菌产地分类的最佳方法。