基于UPLC-QqQ-MS/MS同步检测热加工食品中典型晚期糖基化终末产物

程威威，王 霞，张忠飞，刘国琴，陈 峰，郑家荣,*

（1.深圳大学高等研究院，深圳食品产业创新发展研究院，深圳市海洋微生物组工程重点实验室，广东 深圳 518060；2.华南理工大学食品科学与工程学院，广东 广州 510640）

晚期糖基化终末产物（advanced glycation end products，AGEs）是食品加工过程中伴生化学危害物，主要是还原糖与蛋白质的自由氨基或与游离氨基酸经美拉德反应等途径形成的一系列稳定聚合产物的总称，其中羧甲基赖氨酸（Nε-carboxymethyllysine，CML）和羧乙基赖氨酸（Nε-carboxyethyllysine，CEL）是2 个典型的AGEs，其含量常被用作食品中AGEs生成的指标[1-6]。食源性AGEs能够进入人体血液循环，与人体内氧化应激和炎症的发生密切相关，这也是导致一系列慢性疾病发生及加重的关键因素，包括糖尿病并发症、神经退行性疾病和心血管疾病等[7-10]。因此，近年来针对食品中AGEs的研究越来越受到关注和重视。

富含碳水化合物、脂肪和蛋白质的食品在热加工过程中容易产生AGEs，如烘焙食品和煎炸食品[11-14]，是膳食中公认的AGEs的重要来源[15]。近年来，研究者发现婴儿食品如配方奶粉中也存在一定量的AGEs[16-18]。目前，我国尚未制定食品中AGEs检测方法的国家标准，也无食品中AGEs的限量标准。原因可能是食品基质组分复杂，且差异较大，导致存在不同的基质效应，难以建立统一有效的前处理和定量方法，这不利于不同类型食品中AGEs的含量比较。

建立不同食品中高效、准确、低成本的AGEs检测以及鉴定的通用方法，是工业抑制食品生产加工中AGEs生成的重要基础。目前，已报道的食品中CML和CEL同步检测方法主要有酶联免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法、高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法、气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GCMS）法和高效液相色谱-质谱（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）法[19-24]。ELISA法需要特定的抗体，并且样品的基质效应对方法灵敏度的影响很大，故可能导致较大的误差。HPLC和GC-MS法通常需要柱前衍生化，可操作性差且检测灵敏度较低。HPLC-MS法具有操作简单，可重复性和稳定性高的优点，故通常用于测定CML和CEL含量。

超高效液相色谱（ultra-high performance liquid chromatography，UPLC）技术是在HPLC基础上，涵盖了小颗粒填料、非常低系统体积（死体积）及快速检测手段等全新技术，增加了分析的通量、灵敏度及色谱峰容量，故分离度更好，检测速度快，消耗溶剂少。三重四极杆质谱在保留四极杆质谱原有定量能力强的特点上，提供了串级功能，加强了质谱的定性能力，信噪比更优。目前超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱（ultrahigh performance liquid chromatography-triple quadrupoletandem mass spectrometry，UPLC-QqQ-MS/MS）技术已应用于食品中组分和外源物含量分析[25-27]，但其对食品中CML和CEL的检测鲜有报道。因此，本研究旨在基于UPLC-QqQ-MS/MS技术，建立适用于不同热加工食品中CML和CEL含量同步检测的通用方法，并进行方法学评价，为食品中CML和CEL测定方法的国家标准制定提供数据基础和方法参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

白莲蓉月饼、鸡仔饼、曲奇、杏仁饼、老婆饼、面包、婴儿饼干、婴儿肉松、婴儿米饼、方便面、油条均购自深圳市内各大型超市，鸡米花、薯条购自某快餐连锁品牌店。

CML标准品（纯度≥98%）、CEL标准品（纯度≥98%） 加拿大TRC公司；硼氢化钠（纯度≥98%） 广东西陇科学股份有限公司；四硼酸钠·十水合物（纯度≥99.9%）、盐酸、正己烷、氯仿、乙腈、甲醇、氨水、氢氧化钠（均为分析纯） 上海麦克林生化科技有限公司；乙酸铵、甲酸（均为色谱纯）上海赛默飞世尔科技有限公司；乙腈（色谱纯） 德国Merck公司。

1.2 仪器与设备

ACQUITY UPLC H-Class/Xevo TQ-XS超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱（配有电喷雾离子源、色谱工作站和温控柱温箱）、Oasis MCX固相萃取柱（3 mL/60 mg）、ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm） 美国Waters公司；Heraeus Multifuge XIR型高性能通用台式离心机 美国Thermo Fisher公司；Scientz-10N型冷冻干燥机 宁波新芝生物科技股份有限公司；Milli-Q IQ7005超纯水纯化系统 美国Millipore公司；QUINTIX65-1CN型分析天平 德国Startorius公司；WD-12型水浴氮吹仪 杭州奥盛仪器有限公司；Vortex-Genie2型涡旋混合器 美国Scientific Industries公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液的配制

分别精确称量10.0 mg CML和CEL分别溶于10 mL超纯水中，配制质量浓度为1.00 mg/mL的CML和CEL标准储备液，置于-20 ℃保存。将标准储备液按一定比例稀释，配制质量浓度为1.00 μg/mL的CML和CEL混合标准溶液工作液，置于-4 ℃密封保存。制作标准曲线时，将工作液按比例稀释，配制质量浓度分别为0.100、0.250、0.500、2.00、10.0、25.0、50.0、100、200、500 ng/mL的CML和CEL混合标准系列溶液。基质标准工作溶液：根据样品类型选取适合的空白基质，向空白基质样品中分别添加上述已配制的系列混合标准溶液，进行前处理，得到0.100～500 ng/mL的基质标准系列溶液，然后吸取部分转入液相色谱进样瓶。

1.3.2 样品前处理

样品冷冻干燥后用料理机研碎，置于-20 ℃保存。准确称量0.500 g样品粉末于50 mL离心管中。向样品中加入5 mL正己烷，振荡3 min混匀后，8 000 r/min离心6 min，弃去溶剂，重复以上脱脂步骤1 次后，45 ℃氮吹干至样品恢复粉末状。向样品中加入5 mL硼酸盐缓冲液（0.2 mol/L，pH 9.2）和2.5 mL硼氢化钠溶液（1 mol/L溶于0.1 mol/L NaOH溶液），在4 ℃冰箱中还原过夜。然后向还原液中加入4 mL氯仿-甲醇（2∶1，V/V）混匀，5 000 r/min离心10 min后，弃去上清液，转移沉淀至消解管中，用氮气室温吹扫1 min，加入5 mL 6 mol/L的盐酸，110 ℃水解24 h。水解液冷却至室温，用定性滤纸过滤后，纯水定容至25 mL，吸取2 mL滤液，冷冻干燥，再用2 mL纯水复溶。

分别用3 mL甲醇和3 mL水活化Waters Oasis MCX固相萃取小柱（3 mL/60 mg），取1 mL上述溶液作为上样液，再用3 mL水，3 mL甲醇淋洗，最后用5 mL氨化甲醇（5∶95，V/V）洗脱。将洗脱液在50 ℃氮吹干，复溶于400 μL 2%乙腈溶液中，取50 μL稀释至1 mL，在13 000 r/min离心6 min后，上清液供UPLC-QqQ-MS/MS测试。

1.3.3 UPLC条件

采用ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）。流动相A为乙腈，流动相B为水（含0.1%甲酸和1 mmol/L乙酸铵），梯度洗脱程序如表1所示。流速0.1 mL/min，进样量1.0 μL，柱温30 ℃。

表1 梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution program

1.3.4 MS条件

电喷雾离子源，正离子模式；载气：高纯氦（纯度≥99.999%）；毛细管电压3.5 kV；脱溶剂温度400 ℃；脱溶剂气流量600 L/h；锥孔气流量150 L/h；离子源温度120 ℃；碰撞气流量0.17 mL/min；多反应监测模式。

CML：定量离子：m/z205＞84，锥孔电压38 V，碰撞能量16 eV；定性离子：m/z205＞130，锥孔电压38 V，碰撞能量10 eV；

CEL：定量离子：m/z219＞84，锥孔电压24 V，碰撞能量20 eV；定性离子：m/z219＞130，锥孔电压24 V，碰撞能量12 eV。

1.4 数据统计

每个实验平行测定至少3 次，采用SPSS 22.0软件对数据进行统计学分析，结果以表示，由Origin 2019软件作图。

2 结果与分析

2.1 样品前处理条件优化

CML和CEL分析的样品预处理是基于硼氢化钠还原-酸水解蛋白-固相萃取法进行。硼氢化钠还原步骤的目的是防止样品酸处理过程中Amadori产物生成新的CML和CEL，导致样品中CML和CEL检测含量高于真实值[28]。因此首先对脱脂样品进行硼氢化钠（1 mol/L溶于0.1 mol/L NaOH溶液）过夜还原处理，然后用氯仿-甲醇混合溶剂沉淀蛋白，弃去上清液，对蛋白沉淀物进行酸水解，最后利用SPE柱对水解液进行分离纯化，通过比较回收率得到最佳的SPE柱为Waters Oasis MCX SPE前处理小柱（3 mL/60 mg）。经优化后最终确定的样品前处理条件见1.3.2节。

2.2 仪器条件的优化

CML和CEL极性较强，很难在普通的反相色谱柱上进行保留。前期的报道多采用C18反相硅胶柱对CML和CEL进行分离，以九氟戊酸为洗脱液。然而，九氟戊酸能使流动相的pH值偏低（＜2.0），导致色谱柱的损伤[29]。为了避免九氟戊酸的使用，本研究选择极性修饰十八烷基硅烷健合硅胶色谱柱（Waters ACQUITY HSS T3）对样品中CML和CEL进行分离，并优化UPLC条件。

在多反应监测模式下对CML和CEL的质谱条件进行优化。采用电喷雾正离子模式对CML和CEL混合标准溶液进行扫描，得到一级全扫描质谱图，以两者的分子离子峰[M+H]+理论精确质量数提取色谱图，如图1所示。优化后的Q-MS/MS条件见1.3.4节。

图1 混合标准溶液中CML（A）和CEL（B）的提取离子流色谱图Fig.1 Extracted ion chromatograms of CML (A) and CEL in a mixed standard solution (B)

2.3 方法学评价

2.3.1 基质效应

基质效应是指样品中除目标物以外的其他内源性物质与目标物共洗脱出的样品基质对目标物的离子化过程产生影响，造成离子化增强或抑制，从而影响检测结果的可靠性和准确性[30]。热加工食品样品基质较为复杂，虽然UPLC-QqQ-MS/MS的抗干扰能力较强，但基质效应仍然存在，因此，需要对基质效应进行评价，本研究选取曲奇、婴儿肉松和薯条分别为烘焙类食品、婴儿食品和煎炸食品的代表，将CML和CEL标准品分别用乙腈和3 种食品基质提取液配制标准溶液（0.250～500 ng/mL），以相同物质在食品基质溶液中标准曲线斜率与纯溶剂中标准曲线斜率的百分比值评价基质效应情况，结果如表2所示。基质效应大于100%时，表明基质使目标物离子化增强；基质效应小于100%时，表明基质使目标物离子化减弱。结果表明，CML和CEL在不同食品基质中均存在明显的离子抑制现象，且同一物质在不同食品中基质效应差异较小。由于基质效应的存在，本方法在定量时采用空白基质配标，以降低基质效应的影响。

表2 CML和CEL在不同食品中的基质效应Table 2 Metrix effects of different foods for CML and CEL determination

2.3.2 方法检出限、定量限和线性范围结果

配制不同质量浓度（0.250～500 ng/mL）的CML和CEL混合标准系列溶液，以标准样品质量浓度为横坐标（x，ng/mL），定量离子对的信号响应峰面积为纵坐标（y），绘制标准曲线。在空白基质样品中添加CML和CEL标准溶液，分别以信噪比RSN=3和RSN=10对应的质量浓度确定方法的检出限和定量限，结果如表3所示。CML和CEL的检出限和定量限均分别低于朱玉洁[31]报道的UPLC-MS/MS方法（15.0 ng/g和45.0 ng/g）和Lin Qin等[32]报道的UPLC-Q-TOF/MS法（100 ng/g和300 ng/g），CML和CEL在0.25～500 ng/mL范围内，具有良好的线性关系（R2＞0.999）。

表3 CML和CEL的线性方程、相关系数R2、方法检出限、定量限与线性范围Table 3 Linear equations, correlation coefficients, limits of detection and limits of quantification of CML and CEL

2.3.3 加标回收率和精密度结果

为了评估该方法的准确性，以油条为热加工食品中的代表，用作基质样品，分别添加3 个水平（低、中、高）CML和CEL标准溶液，以基质样品为基准计算回收率。根据油条样品中CML和CEL含量（10.64 μg/g和2.17 μg/g，干基），加标量（以干基计）分别选取为CML：5、10、20 μg/g，CEL：1、2、4 μg/g。对加标样品平行测定6 次，连续测量3 d，得到仪器日内和日间精密度，结果如表4所示。此方法测定CML和CEL的回收率分别为96%～103%和94%～107%，日内精密度分别为1.48%～2.02%和1.23%～1.66%，日间精密度分别为1.52%～2.43%和1.41%～1.84%。数据表明此方法用于定量分析典型AGEs具有较高的准确性和稳定性，能够较可靠地测定油条样品中CML和CEL含量。

表4 CML和CEL的加标回收率与相对标准偏差（n=6）Table 4 Recoveries and relative standard deviations of CML and CEL in spiked samples (n= 6)

2.4 市售热加工食品样品分析评价

采集市场上的13 种烘焙类食品、婴儿食品和油炸类食品样品经过前处理后，用已建立的UPLC-QqQMS/MS法进行含量测定，如表5所示。从测定结果看，除婴儿米饼（26.49 μg/g）外，婴儿肉松和婴儿饼干中CML含量（232.90 μg/g和155.46 μg/g）显著高于烘焙食品（15.33～68.67 μg/g）和油炸食品（6.97～19.73 μg/g）（P＜0.05）。烘焙类食品包括饼干、曲奇、面包等的CML平均含量（36.36 μg/g）高于油炸类食品（12.78 μg/g）包括方便面、鸡米花、薯条、油条等，这可能与烘焙温度（＞200 ℃）高于煎炸温度（～180 ℃）有关。婴儿肉松中CEL含量（108.90 μg/g）明显高于其他食品，是其他食品的5.82～45.56 倍。另外，同一种食品中CEL含量低于CML含量，这与Troise等[33]的结果一致。婴儿食品的安全性关系到婴儿的健康发育和成长，是人们最关注的食品安全问题之一。因此，针对婴儿食品尤其是婴儿肉松中CML和CEL含量较高的现象，探讨婴儿食品体系中CML和CEL的生成规律和抑制策略是后续研究的重点工作之一。

表5 市售13 种烘焙食品、婴儿食品和煎炸食品中CML和CEL含量Table 5 CML and CEL contents in baked foods, baby foods, and fried foods determined by the proposed method

3 结 论

本研究通过对不同热加工食品脱脂、还原、蛋白沉淀、酸水解和固相萃取等前处理条件以及色谱-质谱分析条件的选择和优化，基于基质匹配外标法定量，建立UPLC-QqQ-MS/MS对热加工食品中CML和CEL的同步检测方法。该方法可操作性强，分析时间短，检测成本低，基质干扰小，检出限低，回收率高，且具有良好的分离效果，可适用于不同热加工食品样品中CML和CEL的测定分析。