黎药裸花紫珠散剂质量标准研究

侯 杰，周欣欣，张俊清，2，赖伟勇，2

（1.海南医学院药学院，海南 海口571199；2.海南省热带药用植物研究开发重点实验室，海南 海口571199；3.哈尔滨工商大学，黑龙江 哈尔滨150076）

裸花紫珠（Callicarpa nudiflora Hook.ex Arn.）是马鞭草科紫珠属植物，主要分布于我国广东、广西和海南等地。现代药理活性研究表明裸花紫珠中黄酮类和三萜及其苷类、苯丙素苷和环烯醚萜苷为其主要成分［1］。裸花紫珠具有止血、抗炎、抑菌、增强免疫、细胞毒等作用［2-5］。裸花紫珠的止血抗炎功效被得到了广泛研究，利用裸花紫珠研制止血膏剂、喷雾剂等［4，6］，并对不同止血剂型进行了质量标准研究。本研究从裸花紫珠散剂的鉴别（薄层色谱）、重金属及有害元素限量检查、主要有效成分含量检测（高效液相色谱）等方面较系统研究质量标准，为裸花紫珠散剂的进一步开发利用提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

裸花紫珠散剂（课题组制备），甲醇、乙酸乙酯、三氯化铝、乙醇、盐酸、硫脲、抗坏血酸、高氯酸、硝酸、铁氰化钾均为分析纯，甲酸、乙腈为色谱纯。木犀草苷对照品、毛蕊花糖苷对照品；砷（As）、铅（Pb）、汞（Hg）、镉（Cd）、铜（Cu）元素标准溶液（中国标准物质中心）；砷、铅、汞、镉、铜元素灯。

1.2 仪器与设备

原子吸收光谱仪（ICE3000赛默飞美国）、原子荧光光谱仪（AFS-830北京）、高效液相色谱仪（waterse2695美国）

1.3 方法

1.3.1 裸花紫珠散剂薄层鉴别项的建立 供试品溶液的制备：取三批裸花紫珠散剂各1 g，分别放入25 mL容量瓶中，加甲醇定容至25 mL，超声30 min。放冷，用甲醇补足。摇匀，滤过，取滤液，即得。

对照品溶液的制备：精密称取木犀草苷对照品，加甲醇配置成0.2 mg/mL的木犀草苷标准溶液，作为木犀草苷对照品溶液。精密称取毛蕊花糖苷对照品，加甲醇配置成1.0 mg/mL的毛蕊花糖苷标准溶液，作为毛蕊花糖苷对照品溶液。

薄层鉴别方法：取上述方法制备对照品溶液和供试品溶液，分别点于同一0.5%NaOH硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯∶甲酸∶水（28∶2∶3）为展开剂，展开，取出晾干，喷以3%三氯化铝乙醇溶液，105℃加热5 min，于紫外光（365 nm）下检视。

专属性实验：取3批裸花紫珠散剂供试品溶液、对照品溶液，空白溶液（甲醇），按照上述方法做薄层鉴别实验两次，记录薄层色谱图。

重现性实验：取3批裸花紫珠散剂供试品溶液、对照品溶液，由两名实验人员照A和B按照上述方法做薄层鉴别实验，记录薄层色谱图。

耐用性实验：取3批裸花紫珠散剂供试品溶液、对照品溶液，按照上述方法但使用两批不同批次的薄层色谱板进行实验，记录薄层色谱图

薄层鉴别项检验：分别吸供试品溶液、对照品3种溶液各10～20μL，依次点于同一薄层色谱板进行实验，记录薄层色谱图。

1.3.2 重金属及有害元素检查项的建立 对照品溶液的制备：取砷、铅、汞、镉、铜元素标准储备液分别于100 mL容量瓶中制得到各含元素1、1、0.1、0.1、100μg/mL的母液。测定砷含量时取母液0.0、0.1、0.2、0.5、0.8、1.0 mL，分别加入5 mL盐酸、2%硫脲与1%抗坏血酸后加纯水定容至100 mL；测定铅含量时取母液0.0、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mL，分别加入1.5 mL盐酸后加纯水至100 mL；测定汞含量时取母液0.0、0.1、0.2、0.5、0.8、1.0 mL，分别加入5 mL盐酸后加纯水至100 mL；测定镉、铜含量时取母液0.0、0.2、0.5、1.0、2.0、3.0 mL，分别加入1.5 mL盐酸后加纯水定容至100 mL。即得各元素的对照品溶液。

供试品溶液的制备：3批次裸花紫珠散剂各取1 g，分别加10 mL纯水、1.5 mL高氯酸、15 mL硝酸后置于电热板上消化。消化后测定砷含量时加2.5 mL盐酸、2%硫脲和1%抗坏血酸后加纯水定容至50 mL，测定铅含量时加1.5 mL硝酸后加纯水定容至50 mL，测定汞含量时加2.5 mL盐酸后加纯水定容至50 mL、测定镉含量时加1.5 mL盐酸后加纯水定容至50 mL、测定铜含量时加1.5 mL盐酸后纯水定容至50 mL。即得各元素的供试品溶液。

仪器参数设置：砷：原子荧光光谱仪，5%盐酸载流，还原溶液为2%硼氢化钾与0.4%KOH，负高压290 V，灯电流75 mA；铅：原子荧光光谱仪，1.5%硝酸与0.2%铁氰化钾载流，还原溶液为1%硼氢化钾与0.2%KOH，负高压270 V，灯电流65 mA；汞：原子荧光光谱仪，5%盐酸载流，还原溶液为0.5%硼氢化钾与0.1%KOH，负高压270 V，灯电流75 mA；镉：原子荧光光谱仪，5%盐酸与2%硫脲载流，还原溶液为2%硼氢化钾与0.4%KOH，负高压270 V，灯电流60 mA；铜：原子吸收光谱仪，测定波长为324.7，灯电流8 mA，火焰类型Air-C2H2。

标准曲线的建立：配制5种重金属元素不同浓度的标准溶液，分别进行检测，建立5种重金属的标准曲线。

精密度试验：随机抽取一瓶供试品溶液，重复测定6次，计算砷、铅、汞、镉、铜元素的平均值。

回收率试验：取已知重金属及有害元素离子含量的样品，分别精密加入高、中、低3个浓度的各元素对照品溶液，按上述方法测定砷、铅、汞、镉、铜元素加标回收率。

样品中重金属及有害元素含量测定：采用上述建立的方法，对3批裸花紫珠散剂样品中5种重金属及有害元素进行检测。

1.3.3 高效液相色谱法含量测定方法的建立 色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.1%甲酸溶液-乙腈（85∶15）为流动相，选择双波长检测，木犀草苷检测波长为350 nm，毛蕊花糖苷检测波长为330 nm；柱温为35℃；流速1.0 mL/min。

供试品溶液的制备：取三批裸花紫珠散剂，各1 g，分别放入具塞锥形瓶中，加70%甲醇50 mL，超声40 min。放冷，用甲醇补足。摇匀，滤过，取续滤液，即得。

对照品溶液的制备：精密称取木犀草苷、毛蕊花糖苷对照品，加70%甲醇配置成每1 mL含木犀草苷20 mg、毛蕊花糖苷250 mg的混合对照品溶液，即得。

标准曲线的绘制：以进样体积为横坐标（X），以峰面积积分值为纵坐标（Y），进行线性回归数据处理，计算出木犀草苷和毛蕊花糖苷的线性回归方程。

含量测定：采用含量测定的方法，取3批裸花紫珠局部用散剂进行含量测定。

2 结果

2.1 薄层色谱鉴别项建立结果

2.1.1 专属性、重现性和耐用性试验结果 专属性试验薄层色谱图中对照品与供试品在相同位置上有相同颜色的荧光点，斑点清晰可见，两种成分分离度较好，见图1。阴性对照溶液无荧光斑点，说明该方法专属性良好。重现性实验结果见图2，两名实验员得到的薄层色谱图基本一致，两份色谱图中对照品与供试品在相同位置上有相同颜色的荧光点，斑点清晰可见，两种成分分离度较好，说明该方法重现性良好。耐用性实验结果见图3，不同批次薄层板得到的薄层色谱图基本一致，对照品与供试品在相同位置上有相同颜色的荧光点，斑点清晰可见，两种成分分离度较好，说明该方法耐用性良好。

图1 专属性试验结果Fig 1 Specific r esults

图2 重现性试验结果Fig 2 Reproducibility results

图3 耐用性试验结果Fig 3 Serviceability results

2.1.2 薄层色谱鉴别项检验结果 3批裸花紫珠散剂供试液在薄层色谱图上与木犀草苷、毛蕊花糖苷对照品色谱相应的位置上，显示相同颜色的荧光斑点。该方法荧光斑点清晰可见，两种成分分离度较好，该薄层色谱鉴别项简单可行。见图4。

2.2 重金属及有害元素检查项试验结果

图4 裸花紫珠散剂薄层检验结果Fig 4 TLC results of callicarpa nudiflora powder

2.2.1 重金属及有害元素标准曲线 以元素浓度为横坐标，吸光度或者荧光值为纵坐标进行线性回归，得到5种重金属及有害元素标准曲线见表1。由表可知，5种重金属及有害元素的相关系数均在0.996以上，表明5种元素线性关系良好。

表1 重金属及有害元素标准曲线Tab 1 Standard curve of heavy metals and harmful elements

2.2.2 精密度及回收率试验结果 随机抽取一瓶供试品溶液，重复测定6次，砷、铅、汞、镉、铜元素平均值分别为2.918、10.015、0.631、0.297、0.044 7（μg/kg），相对标准偏差分别为0.35%、0.13%、2.97%、1.26%、0.82%，表明该方法精密度良好。见表2。

表2 精密度试验结果（μg/kg）Tab 2 Precision results（μg/kg）

砷、铅、汞、镉、铜元素加标回收率平均值分别为96.1%、95.8%、95.4%、98.8%、98.8%，表明该方法能准确测定待测样品中的5种重金属含量及有害元素。见表3。

表3 加标回收率试验结果Tab 3 Recovery results

2.2.3 重金属及有害元素含量测定试验结果 重金属及有害元素含量测定结果见表4，3批裸花紫珠散剂中示砷含量平均值为2.745μg/kg、铅含量平均值为10.413μg/kg、汞含量平均值为0.860μg/kg、镉含量平均值为0.252μg/kg、铜含量平均值为0.046 7 μg/kg。以上重金属及有害元素含量远低于《药用植物及制剂外经贸绿色行业标准》规定的绿色药材重金属限量要求，表明本品重金属及有害元素含量符合要求。

表4 3批散剂的重金属含量（μg/kg）Tab 4 Content of heavy metals in three batches of callicarpanudiflora powder（μg/kg）

2.3 含量检测项建立试验结果

2.3.1 标准曲线绘制 以进样体积为横坐标（X），以峰面积积分值为纵坐标（Y），进行线性回归数据处理，所得到的木犀草苷的线性回归方 程 为：Y=53 342X-36 343，r=1.000 0；毛蕊花糖苷的线性回归方程为：Y=379 198X-152 266，r=0.999 9。见图5。

图5 木犀草苷和毛蕊花糖苷标准曲线Fig 5 Standard curve

2.3.2 含量测定结果 毛蕊花糖苷和木犀草苷的液相色谱图可见图6、7，检测波长330 nm保留时间为23 min处的峰为毛蕊花糖苷，检测波长350 nm保留时间21 min处峰为木犀草苷。对3批裸花紫珠散剂进行木犀草苷和毛蕊花糖苷含量测定，木犀草苷和毛蕊花糖苷的平均含量分别为0.614 7和7.282 2 mg/g，以平均含量的80%为下限，规定裸花紫珠散剂中木犀草苷含量应不低于0.48%，毛蕊花糖苷含量应不低于5.83%，见表5。

图6 毛蕊花糖苷的色谱图Fig 6 HPLC of mullein glycoside

图7 木犀草苷的色谱图Fig 7 HPLC of luteolin

表5 裸花紫珠散剂含量测定结果Tab 5 Content determination results of callicarpa nudiflora powder

3 讨论

本研究建立了裸花紫珠散剂的薄层色谱鉴定法，对此方法用于裸花紫珠散剂鉴定的专属性、重复性、耐用性进行了考察。该方法荧光斑点清晰可见，两种主要成分木犀草苷和毛蕊花糖苷成分分离度较好专属性、重现性、耐用性效果良好，同时基于该薄层色谱法建立了裸花紫珠散剂的薄层鉴别项。

利用火焰原子吸收法和氢化物原子荧光法，建立了裸花紫珠散剂铅、镉、砷、汞、铜5种重金属及有害元素的测定方法，砷、铅、汞、镉、铜5种重金属元素的线性相关系数分别为0.999 1、0.999 1、0.999 8，0.996 4、0.999 6，相对标准偏差分别为0.35%、0.13%、2.97%、1.26%、0.82%，回收率平均值分别为96.1%、95.8%、95.4%、98.8%、98.8%，结果表明该方法准确、稳定。裸花紫珠散剂中砷含量平均值为2.745μg/kg、铅含量平均值为10.413μg/kg、汞含量平均值为0.860μg/kg、镉含量平均值为0.252μg/kg、铜含量平均值为0.046 7μg/kg。以上重金属含量远低于《药用植物及制剂外经贸绿色行业标准》规定的绿色药材重金属限量要求。同时，建立了裸花紫珠散剂鉴别的重金属检查项：按照检测铅、镉、砷、汞、铜含量方法测定，铅不超过5 mg/kg，镉不超过0.3 mg/kg，砷不超过2 mg/kg，汞不超过0.2 mg/kg，铜不超过20 mg/kg。

采用高效液相色谱法测定裸花紫珠中主要有效成分木犀草苷和毛蕊花糖苷的含量，木犀草苷的线性回归方程为：Y=53 342X-36 343，线性相关系数为1；毛蕊花糖苷的线性回归方程为：Y=379 198X-152 266，线性相关系数为0.999 9。含量测定结果，木犀草苷平均值为0.061 47 mg/g、毛蕊花糖苷平均值为7.282 2 mg/g。以平均含量的80%为下限，建立了裸花紫珠散剂含量测定项，规定裸花紫珠散剂中木犀草苷含量应不低于0.48%，毛蕊花糖苷含量应不低于5.83%。

综上所述，本研究所建立的黎药裸花紫珠散剂质量控制方法简单，专属性、准确性、稳定性好，可用于裸花紫珠散剂的质量控制。