RNA测序探讨COPD患者外周血单个核细胞环状RNA表达差异

张 君，詹 峰，孙 娟，丁毅鹏

（1.海南医学院附属海南医院，2.海南省人民医院急诊科，3.海南省人民医院全科医学科，海南 海口570311）

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一种常见的气道疾病，其特征是慢性毛细支气管炎和肺气肿［1］，研究表明，COPD由遗传和环境危险因素相互作用引发的肺部炎症所诱发［2］。预计到2020年成为全球慢性发病与死亡的第3大诱因［3］。研究表明，COPD与严重的新型冠状病毒（COVID-19）相关，COPD合并COVID-19患者致死率更高［4］。

环状RNA（circRNA）是一类非编码RNA［5］，与传统的线性RNA相比，它的分子结构呈闭合环状，不含有3′-ployA尾和5′-帽子结构，不易被核酸外切酶降解，比线性RNA更稳定，种类繁多，广泛分布于不同的组织与结构中，数量为线性mRNA的10倍［6，7］。环状RNA主要通过竞争性结合miRNA，实现对miRNA靶基因的调控［8］，也可以通过直接调控基因表达发挥功能［9］。在COPD［10］、心肌梗死［11］、肿瘤［12］等中发挥重要功能。研究表明，CircRNA 0001859可以作为COPD和急性COPD的新诊断和预后生物标志物［13］。COPD相关环状RNA表达网络与可能调控机制的研究目前尚不太了解。

本研究，通过收集5例COPD患者与5名正常人的外周血单个核细胞，进行环状RNA转录组测序，检测并分析COPD外周血单个核细胞环状类型，环状RNA差异表达，环状RNA来源基因的GO（Gene Ontology，基因本体论）功能聚类与环状RNA来源基因的KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，京都基因与基因组百科全书）信号通路聚类分析。为从环状RNA角度进一步阐述COPD发病机制与环状RNA在COPD中可能的调控机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 测序样本收集

采用紫色抗凝管采集5例50岁左右男性COPD患者和5名50岁左右男性的正常人的外周血。COPD患者来自海南省人民医院急诊科，经2名以上医师根据COPD指南诊断为COPD，正常对照来着海南省人民医院体检中心。全血加入等量体积的PBS混合后加入淋巴细胞分离液（购自上海爱必信生物科技有限公司），充分混合后3 000g离心30 min，移液枪分离出白细胞层并采用PBS漂洗，-80℃冰箱保存备用。

1.2 RNA提取

根据说明书要求，使用Trizol试剂盒（购自美国Invitrogen公司）提取总RNA。在Agilent 2100生物分析仪（购自美国Agilent Technologies公司）上评估RNA质量。提取后，将总RNA用RNase R处理以降解线性RNA，并使用RNeasy MinElute Cleanup Kit（购自荷兰Qiagen公司）进行纯化。

1.3 建库测序

使用用于Illumina的VAHTS总RNAseq（H/M/R）文库制备试剂盒（购自中国南京Vazyme公司）构建了特异性链文库。简要地说，除去核糖体RNA以保留环状RNA。随后将富集的环状RNA打断并反转录成cDNA，并合成反义链，得到双链cDNA。接下来，用VAHTSTM DNA Clean Beads（购自中国南京Vazyme公司）纯化cDNA片段，进行末端修复，添加poly（A），并连接至Illumina测序接头。采用尿嘧啶-N-糖基化酶将另外一链化解。使用VAHTSTM DNA Clean Beads纯化，PCR扩增，并使用Illumina HiSeqTM 2500进行测序。

1.4 环状RNA鉴定与差异分析

将测序得到序列与参考基因组比对，以发现剪接位点内的独特锚定位置。以相反方向（从头到尾）排列的锚定指示环状RNA剪接，然后进行find_circ分析［14］以鉴定环状RNA，并根据GU/AG剪接位点扩展两侧序列。如果至少在一个样品中至少有两个独特的反向剪接读数支持，则称为候选环状RNA。为了鉴定COPD与正常组之间差异表达的环状RNA，使用edgeR软件包分析组间差异（http：//www.r-project.org/，3.12.1版本）。笔者鉴定出以变化倍数Foldchange绝对值≥2且P＜0.05评判为COPD与正常组间具有显著差异的环状RNA。

1.5 环状RNA来源基因功能与信号通路分析

首先，将所有环状RNA来源基因映射到GO数据 库（http：//www.geneontology.org/）［15］中 的GO分类，计算富集P值并经过FDR校正，以FDR≤0.05认为GO功能显著富集。这项分析能够识别出环状RNA来源基因行使的主要生物学功能。KEGG是公共信号通路相关数据库（https：//www.kegg.jp/）［16］。通路富集分析确定了环状RNA来源基因中显着富集的代谢途径或信号转导途径以研究环状RNA来源基因的主要功能与通路，富集计算得出的P值通过FDR校正，以q值（即FDR）≤0.05认为KEGG信号通路显著富集。

2 结果

2.1 环状RNA鉴定与分类

共计鉴定出1 215个环状RNA，其中根据环状RNA在基因组上相对于蛋白编码基因的位置，可将环状RNA划分为六类，其中多个外显子环状RNA（annot_exons）347个、内含子间环状RNA（intronic）16个、一个外显子环状RNA（one_exon）385个、外显子与内含子中间环状RNA（exon_intron）52个、基因间环状RNA（intergenic）257个、反义序列环状RNA（antisense）158个。见图1。

图1 环状RNA各分类数量统计Fig 1 Cir c RNA statistics of the number of categor ies

2.2 COPD显著差异环状RNA

COPD组相对正常对照组（Control），以变化倍数Foldchange绝对值≥2且P＜0.05认为具有显著差异的环状RNA共计187个，其中上调107个，下调80个，差异环状RNA热图见图2。COPD组中上调最显著的前5个差异环状RNA与COPD组中下调最显著的前5个差异环状RNA见表1。

图2 COPD显著差异环状RNA热图Fig 2 Circular RNA heat map of significant difference in COPD

表1 COPD组差异最显著的前5个环状RNATab 1 Top 5 circ RNAs with the most significant difference in the COPD group

2.3 COPD差异环状RNA来源基因GO功能分析

差异的环状RNA，根据其来源的基因进行GO功能聚类，结果显示，根据功能分类内基因数量排序，在生物学过程（biological process）功能分类中变化最明显的功能是细胞过程（cellular process），在细胞成分（cell component）功能分类中变化最明显的功能是细胞（cell），在分子功能（molecular function）功能分类中变化最明显的功能是结合（binding），见图3。可见差异的环状RNA可能主要通过调控细胞结合的细胞过程相关功能基因影响COPD的疾病进展。

2.4 COPD差异环状RNA来源基因KEGG信号通路分析

差异的环状RNA，根据其来源的基因进行KEGG信号通路聚类，结果显示，根据q值（即FDR值）进行排序，变化最明显的前3个通路分别是：非同源末端连接通路（non-homologous end-joining）、铁死亡通路（ferroptosis）与FoxO信号通路（FoxO signaling pathway），见图4。

图3 COPD差异环状RNA来源基因GO功能聚类图Fig 3 COPD differential cir cular RNA host gene GO function cluster map

图4 COPD差异环状RNA来源基因KEGG信号通路聚类图Fig 4 COPD differential circular RNA host gene KEGG signal pathway cluster map

3 讨论

目前已有许多COPD潜在的非编码诊断分子，如mir-146a/b［17］、lncRNA SNHG5［18］以及环状RNA CircRNA 0001859［19］。但是，目前均未进行临床转化应用。环状RNA具有稳定的结构，良好的保守性，组织特异性以及至关重要的生物学功能，这些特性使环状RNA分子可能成为COPD预后的优良生物标志物［19］。本研究中，COPD与正常对照组中共计鉴定出1 215个环状RNA，具有显著差异的环状RNA共计187个，其中上调107个，下调80个。提示，部分环状RNA可能参与COPD发生发展，具有进一步验证与深入探讨的潜力。

环状RNA表达的改变在各种病理状况的发展中起着重要作用，研究表明，环状RNA可以参与炎症［20］、分化［21］、增殖侵袭［22］等功能。基于环状RNA可以通过来源基因［23］、ceRNA［24］、直接结合蛋白［25］等方式调控蛋白表达。笔者通过对COPD差异环状RNA来源基因的GO富集分析，发现了COPD差异环状RNA来源基因功能可能主要是通过调控细胞过程以及分子结合的功能，可能通过调控COPD关键基因表达参与的细胞过程影响COPD发生发展。笔者通过COPD差异环状RNA来源基因的KEGG信号通路分析，发现了COPD差异环状RNA来源基因影响的信号通路主要是非同源末端连接通路、铁死亡通路与Fox O信号通路。非同源末端连接通路是DNA双链断裂后修复的途径之一，参与调控细胞周期并影响增殖［26］，在肿瘤调控中具有重要功能［27］，而非同源末端连接通路可能导致肺气肿中Ⅱ型肺泡细胞死亡［28］。铁死亡通路是一种细胞新型死亡方式，主要通过铁参与的抑制GPX4蛋白促进ROS激活后的脂质过氧化引起的细胞死亡［29］。研究表明，铁死亡参与了COPD的发病过程［30］。研究表明，NCOA 4介导的铁蛋白吞噬作用与香烟烟雾引起的铁死亡可以促进COPD发展［31］。香烟烟雾引起的上皮细胞铁死亡也可以促进COPD的发生发展［32］。Fox O信号通路是Fox O转录因子家族的一个亚家族，在细胞命运决定中起着重要作用，该亚家族也被认为在多种癌症中起着关键的抑癌作用［33］。研究表明，异常激活的EGFR通过调节核FoxO3A促进COPD气道上皮细胞IL-8表达［34］。由此可见，环状RNA调控的非同源末端连接通路、铁死亡通路与FoxO信号通路可能参与COPD等肺部疾病调控，值得进一步探讨。

本研究也存在一定不足：（1）应该进一步扩大COPD与正常样本，采用RT-PCR与FISH检测验证差异环状RNA的表达变化；（2）构建过表达与沉默载体转染，进一步验证环状RNA的功能与调控机制；（3）根据数据库预测与分子生物学实验验证环状RNA的调控机制。这些将是笔者下一步验证与探讨的主要内容。

本研究表明，COPD与正常组间存在差异环状RNA，这些环状RNA可能作为COPD的潜在检测指标，或调控关键分子；且这些环状RNA可能通过非同源末端连接通路、铁死亡通路与FoxO信号通路调控影响COPD。为从环状RNA这个新角度理解COPD的发病机制，以及环状RNA作为COPD潜在的检测与干预靶点提供理论依据。