酶预处理和酸水解制备糯玉米淀粉纳米晶及其表征

高 新 陈启杰 赵雅兰 胡志强 王建辉

(长沙理工大学化学与食品工程学院;湖南省水生资源食品加工工程技术研究中心，长沙 410004)

淀粉是仅次于纤维素的第二大可再生资源，淀粉纳米晶(SNCs)是从天然淀粉中采用物理、化学或生物法制得的一种纳米尺寸的聚多糖晶体[1]，具有来源广、粒径小、热稳定性好、比表面积大、可生物降解等特点，可用作食品乳液稳定剂[2]、食品分离膜[3]，及纳米复合膜增强[4]、药物载体[5]等领域的应用。

酸水解法制备淀粉纳米晶主要包括两个阶段：第一阶段是较快的酸水解阶段，主要是淀粉颗粒中非晶态部分的水解，第二阶段是缓慢水解阶段，主要是与淀粉中结晶部分缓慢降解有关[6]。酸水解法制备淀粉纳米晶保留淀粉颗粒的结晶结构，大部分的淀粉无定型区被水解掉，得率较低，且反应时间长[7]，Putaux等[8]将糯玉米淀粉和盐酸混合，35 ℃反应6周制备淀粉纳米晶，淀粉颗粒尺寸为20～40 nm，得率仅为0.5%；Kim等[9]用不同来源、不同直链含量的淀粉为原料，在40 ℃硫酸水解淀粉7 d，颗粒尺寸40～70 nm，不同来源的淀粉对SNCs的制备影响较大；Angellier等[10]用14.69%糯玉米淀粉溶液和硫酸(3.16 mol/L)在40 ℃下，水解反应5 d，淀粉纳米晶的粒径100 nm，产率仅有15%左右。

生物酶处理是采用酶作用于淀粉颗粒表面以及内部较易水解的非结晶区，使淀粉的非还原末端逐渐水解，改变淀粉的黏度和聚合度(DP)。生物酶可以使淀粉颗粒破碎，H+更容易进入颗粒内部，使非结晶区水解更彻底，且绿色环保。Kim等[11]采用纯酶对糯米淀粉进行水解，表明淀粉颗粒中的非晶区可以通过α-淀粉酶选择性地去除；LeCorre等[12]研究α-淀粉酶、β-淀粉酶和糖化酶制备SNCs，糖化酶对糯玉米淀粉水解6 h后，能达到正常酸水解24 h的效果。糖化酶又称葡萄糖淀粉酶，同α-淀粉酶、β-淀粉酶相比，糖化酶能有效的破坏淀粉颗粒表面的形貌；糯玉米淀粉中支链淀粉达到95%以上，是一类多聚糖类物质，广泛应用于食品工业。本研究采用糖化酶预处理糯玉米原淀粉，酶解原淀粉颗粒的部分无定形区，结合硫酸水解法处理制备糯玉米淀粉纳米晶，探讨糯玉米淀粉纳米晶的制备工艺，并对糯玉米淀粉纳米晶进行表征，为其工业生产和应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

糯玉米淀粉、糖化酶(20 000 U/mL)；柠檬酸、磷酸氢二钠、氢氧化钠、硫酸均为分析纯。

1.2 主要仪器

D/MAX2200X X射线衍射仪，Zetasizer Nano ZS 激光粒度分析仪，Vertex傅里叶变换红外光谱仪，Quanta 250 FEG扫描电子显微镜，FD-1A-50冷冻干燥机，TG16-WS台式高速离心机。

1.3 方法

1.3.1 淀粉纳米晶的制备

1.3.1.1 生物酶预处理

称取一定量的糯玉米原淀粉，置于盛有150 mL、pH=4的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的三口烧瓶中，加入一定量的糖化酶溶液，然后将三口烧瓶置于60 ℃的水浴锅中，以200 r/min速度机械搅拌，反应2 h，待反应结束后，用1 mol/L的NaOH调pH，直至pH>7，停止酶解。将其置于12 000 r/min的高速离心机中离心10 min，将得到的沉淀物置于35 ℃的烘箱中烘干后备用。

1.3.1.2 酸水解

酸水解工艺是将酶预处理的淀粉制备成淀粉纳米晶。称取一定量的酶预处理的淀粉，置于盛有250 mL、3.16 mol/L的硫酸的三口烧瓶中，然后将三口烧瓶置于40 ℃的水浴锅中，以200 r/min速度机械搅拌，反应一段时间。待反应结束，以12 000r/min的速度将产物进行离心，然后用蒸馏水洗涤，重复多次直至离心后的上清液pH恒定，最后将所得固体进行真空冷冻干燥，得到SNCs。

1.3.2 X射线衍射仪(XRD)分析

用X射线衍射仪测定。测试条件为管压30 kV，管流30 mA，扫描速度为1(°)/min，扫描区域为10°～40°接受狭缝0.3 mm。通过MDI jade 6.5计算相对结晶度。

1.3.3 粒径和Zeta电位测量

用激光粒度分析仪对样品进行粒径分布和Zeta电位测量，用0.1mol/L的NaOH将混合溶液的pH值调整到7.0，再加入蒸馏水将样品配制成0.01%的悬浮液，在超声分散器下处理10 min后再测定其粒径分布和Zeta电位。

1.3.4 淀粉纳米晶产率的计算

采用电子天平称量冷冻干燥后的淀粉纳米晶的质量，其产率的计算公式如下：

Y=m1/m×100%

式中：m1为冷冻干燥后淀粉纳米晶的质量/g，m为糯玉米原淀粉的绝干质量/g，Y为淀粉纳米晶的产率/%。

1.3.5 傅里叶红外光谱(FT-IR)分析

釆用KBr压片法，将样品按比例1%与KBr充分混合，混合物在研钵中研磨，随后将其放置在压膜器中压片，样品薄片于红外光谱仪(Vertex70 v，德国)上测试，扫描范围从4 000 cm-1到4 00 cm-1，分辨率为2 cm-1。

1.3.6 扫描电子显微镜(SEM)观察

采用扫描电子显微镜观察，将样品研成粉末，取0.1 mg样品粘在导电胶上，对样品进行喷金，之后将样品置于干燥器中加速电压为30 kV，观察并拍摄具有代表性的颗粒形貌。

1.3.7 数据统计与分析

每个实验至少进行三次重复实验，利用Origin8.0软件对平均值和标准差进行分析，采用Excel 2016进行统计分析，在95%置信水平上估计平均值之间的显著差异(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 XRD分析

糯玉米原淀粉和不同酶用量的酶预处理淀粉的XRD如图1所示，糯玉米原淀粉和酶预处理淀粉的X射线衍射峰型相同，2θ在15°、17°、18°、23.5°附近出现了明显的衍射峰，说明糯玉米原淀粉经过糖化酶处理后没有改变其结晶结构，仍保持典型的A晶型[13]。糯玉米原淀粉的相对结晶度(RC)是33.99%，当糖化酶的用量为500、1 000、1 500、2 000 U/g时，酶预处理淀粉的RC分别为33.18%、32.26%、27.76%、24.66%。随着糖化酶用量的增加，淀粉的RC逐渐降低，当糖化酶的用量为1 500 U/g时，其RC下降了6.73%，表明此时淀粉的晶体结构被酶破坏的较严重，不利于后续采用酸水解制备淀粉纳米晶[14]。因此，对淀粉颗粒造成更高程度损伤的同时尽可能保护结晶结构，选择糖化酶用量为1 000 U/g制备的酶预处理淀粉作为后续酸水解处理的淀粉。

注：a 糯玉米原淀粉，b-e依次为500，1 000、1 500、2 000U/g淀粉。 图1 淀粉X射线衍射图

2.2 粒径分析

糯玉米原淀粉和1 000 U/g酶预处理糯玉米淀粉分别酸水解1～5 d制备的SNCs的粒径分布如图2所示。糯玉米原淀粉的粒径集中在10 μm左右，1 000 U/g酶预处理淀粉的粒径集中在5 μm左右，表明糖化酶预处理淀粉使淀粉颗粒明显变小，这是因为在酶水解过程中，糖化酶分子首先攻击淀粉颗粒比较疏松的无定型区，从而导致粒径减小。糯玉米原淀粉酸水解粒径分布曲线，随着水解时间的延长，都明显向左移动，酶预处理淀粉酸水解的粒径分布曲线也都明显向左移动，表明随着水解天数的增加，制备的纳米晶粒径越来越小。糯玉米原淀粉酸水解5 d制备的SNCs粒径分布在100～200 nm，而酶预处理后的淀粉酸水解5 d的SNCs粒径分布在50～100 nm。同时，由图2可以看出1 000 U/g酶预处理淀粉水解2 d的SNCs粒径分布在80～200 nm，和糯玉米原淀粉酸水解5 d的SNCs的粒径分布相似，表明酶预处理淀粉酸水解2 d就可以达到原淀粉单纯酸水解5 d制备的SNCs的效果。

图2 酸水解制备的SNCs粒径分布

2.3 产率分析

糯玉米原淀粉和1 000 U/g酶预处理淀粉酸水解1～5 d的产物SNCs的平均粒径和产率如表1所示。由表可以看出，随着酸水解时间的增加，糯玉米原淀粉酸水解制备SNCs的粒径越来越小，产率越来越低。1 000 U/g酶预处理淀粉酸水解制备SNCs的粒径也随着酸水解时间的增加，粒径越来越小，产率越来越低，但酶预处理淀粉制备SNCs产率降低的速率比糯玉米原淀粉制备SNCs的速率要慢，这可能是因为酶预处理淀粉的非结晶区已经被充分水解，剩下淀粉的结晶区比较紧凑，不易被水解。糯玉米原淀粉酸水解5 d的SNCs的平均粒径为(113.2±6.1) nm，其产率为(14.1±1.7)%。而酶预处理淀粉酸水解2 d SNCs的平均粒径就达到(112.1±8.9)nm，其产率为(24.1±1.6)%，产率较糯玉米原淀粉水解法提高了70.9%，酶预处理淀粉酸水解5 d的SNCs的平均粒径为(50.7±4.2)nm，远小于糯玉米原淀粉水解5 d制备的SNCs(113.2±6.1) nm。采用酶预处理和酸水解相结合制备SNCs，缩短了反应时间且提高了SNCs的产率。

表1 SNCs的粒径和产率

2.4 Zeta电位分析

图3是糯玉米原淀粉和1 000 U/g酶预处理淀粉酸水解1～5 d得到SNCs的Zeta电位值。由图可以看出，SNCs的Zeta电位均为负值，表明SNCs的表面带负电荷，这和Angellier[15]报道结果一致。糯玉米原淀粉随着酸水解天数的增加，SNCs 的Zeta电位的绝对值明显增加，1 000 U/g酶预处理淀粉也随酸水解天数的增加，水解产物SNCs 的Zeta电位的绝对值明显增加。Zeta电位是用来表示胶体溶液的稳定性，衡量颗粒之间排斥力和吸引力的大小，即Zeta电位绝对值越高，溶液的稳定性越好[16]。糯玉米原淀粉水解5 d制备的SNCs的Zeta电位绝对值为16.2 mV，与酶预处理淀粉水解2 d的SNCs的Zeta电位的绝对值16 mV相近，酶预处理淀粉水解3、4、5 d的SNCs的Zeta电位的绝对值分别为18.1、20.3、22.3 mV，都大于糯玉米原淀粉水解5 d的SNCs 的Zeta电位的绝对值，表明采用糖化酶预处理和酸水解制备的SNCs的稳定性提高，酶预处理淀粉酸水解2 d产物的分散体系就能达到糯玉米淀粉单纯酸水解5 d产物分散体系的稳定性。

图3 糯玉米原淀粉和1 000 U/g酶预处理淀粉酸水解1～5 d的淀粉纳米晶Zeta电位值

2.5 傅里叶红外光谱(FT-IR)分析

图4是糯玉米原淀粉、1 000 U/g酶预处理淀粉和酶预处理淀粉酸水解2 d SNCs的FT-IR图。由图4可以看出，糯玉米原淀粉、酶解淀粉和SNCs的图谱相似，表明它们的结构基本相似。糯玉米淀粉、酶解淀粉和SNCs在3 468 cm-1处有一个很宽的吸收峰，这可能是葡萄糖单元中O—H基团的伸缩振动；在2 971 cm-1附近中等强度的吸收峰可能是C—H基团在葡萄糖单元上的收缩振动；1 650 cm-1附近的吸收峰可能是由淀粉中残留结合水中的O—H拉伸振动引起的[17]；以1 452 cm-1为中心的吸收峰可能是由苄基环骨干伸缩振动引起的[18]。在指纹区，1 156 cm-1附近的吸收峰是C—O—C基团的O—C拉伸振动[19]，1 083 cm-1处波段的吸光度归因于C—O伸缩振动和C—C骨架振动的复合性能。在1 020 cm-1附近的吸收峰是淀粉非晶区的结构特征，对应于淀粉状态结构中的有序结构，989 cm-1附近的特征峰主要是由C—O的弯曲振动引起的，对应于淀粉大分子羟基之间形成的氢键结构。而SNCs在1 650 cm-1处的吸收峰略有下降，可能是由于淀粉结构中的结合水被去除，导致O—H弯曲振动降低了SNCs的强度[20]。与在1 020 cm-1处的吸收峰相比，SNCs的强度略微增加，可能是因为非晶区被水解，与其他样品在1 104 cm-1处相比，SNCs的吸收峰强度轻微增加，可能是由于淀粉纳米晶表面吸附了少量的硫酸根。

注：a 糯玉米原淀粉；b 1 000 U/g酶预处理淀粉和；c 酶预处理淀粉酸水解2 d的SNCs。图4 淀粉和SNCs的FT-IR

2.6 扫描电子显微镜(SEM)分析

图5是糯玉米原淀粉、1 000 U/g酶预处理淀粉和酶预处理淀粉酸水解2 d的SNCs的SEM，由图5可以看出，糯玉米原淀粉的颗粒形状大多数都是圆形或是椭圆形，结构紧凑、致密，且颗粒表面相对光滑。经过糖化酶处理后的酶预处理淀粉的颗粒多数呈现为圆形或是椭圆形，颗粒表面出现孔隙、凹陷、孔洞，但还能保持完整颗粒形状，酶解淀粉表面的裂纹、孔洞和凹陷，使H+更容易进入淀粉颗粒内部，促进酸在淀粉颗粒中的扩散，使非晶区更容易水解，缩短了制备SNCs的时间[21]。酶预处理及酸水解制备的SNCs的颗粒多数呈现不规则形态，表面有裂纹但仍能保持完整的形状。

注：a 糯玉米原淀粉；b 1 000 U/g酶预处理淀粉；c 酶预处理淀粉酸水解2 d的SNCs。图5 淀粉和SNCs的SEM

3 结论

采用XRD研究糖化酶预处理对糯玉米淀粉的结晶结构变化，1 000 U/g糖化酶对糯玉米原淀粉进行酶预处理，部分水解淀粉的无定型区和结晶区，再结合硫酸水解2 d，制备得到粒径约100 nm、Zeta电位达-22.3 mV、产率为24.1%的糯玉米淀粉纳米晶。同仅采用酸水解相比，酶预处理结合酸水解制备淀粉纳米晶使反应时间缩短了3 d，SNCs产率增加了70.9%，为糯玉米淀粉纳米晶的制备提供了新途径，且更绿色环保。