肉桂精油对甘薯贮藏期间长喙壳菌侵染的防控效果

成纪予 陆雅清 汤陈依 王 姝 庞林江 陆国权 路兴花

(浙江农林大学农业与食品科学学院；浙江省农产品品质改良技术研究重点实验室，杭州 311300)

甘薯(Ipomoeabatatas(L.)Lam.)是发展中国家许多地区一种重要粮食作物，广泛种植于热带、亚热带地区[1]。亚洲是甘薯的主要生产区，据FAO统计，2018年产量为6 071万t，占全球产量的66%[2]。甘薯营养丰富，不仅可以作为能量补充，还可以作为生物活性植物化学营养源，被视为是营养平衡全面的绿色保健食品[3, 4]。

新鲜甘薯块根含水量高、表皮脆弱，在收装运过程中极易遭受机械损伤，病原菌亦容易侵染，导致采后病害发生严重，造成损失及贮藏困扰[5]。甘薯黑斑病是由甘薯长喙壳菌(CeratocystisfimbriataEllisetHalsted)侵染导致的一种病害，不仅发生在田间，在贮藏期间亦有发生，每年我国由该病害导致的甘薯产量损失5%～10%，发病严重时为20%～50%[6]。甘薯长喙壳菌是一种致病性真菌，通过分泌毒素侵染寄主，杀死寄主组织，从中汲取养分，进而对寄主的生理生化过程和组织结构造成破坏，使寄主迅速萎蔫以及细胞组织大范围转为暗黑色，再变为黑色或深褐色，直至腐烂[7]。高温高湿环境利于甘薯长喙壳菌侵染产生病害，通过高于15 ℃开始发病，温度越高，发病率越高，且病情严重，高于35 ℃或低于9 ℃病情则会被抑制[8]。长喙壳菌侵染过程会产生甘薯酮、甘薯宁、甘薯醇、4-薯醇等耐高温的毒素，使甘薯变得又苦又毒[9]。

目前国内外对于甘薯黑斑病防治主要从抗病品种筛选[10，12]和化学药剂筛选[13, 14]方面开展研究，其中以化学防治为主。但随着致病菌的耐药性不断增加，化学试剂残留量易超标，进而威胁人体健康，并造成环境污染。植物精油天然、安全、对环境友好，具有较强的抑菌活性，且不易产生抗性[15]，已越来越多地被用于抑制蓝莓、樱桃、香蕉等果蔬采后病原菌的生长，降低采后病害的发生[16，18]，提高贮藏品质及延长货架期。

本研究首先通过体外抑菌实验，从12种常见植物精油中筛选出对甘薯长喙壳菌抑制效果最佳的精油品种；进一步通过人工接种的方式，验证其在甘薯体内的抑菌效果，以期为植物精油应用于甘薯采后黑斑病害防控提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试甘薯：为鲜食为主品种“心香”，由浙江农林大学薯类研究所甘薯种植基地提供。选择无机械损伤、腐烂变质、大小基本一致的同一批收获新鲜甘薯为实验材料。

供试精油：中国薄荷、迷迭香、百里香、茶树、欧洲薄荷、月桂、香芹酮、山鸡椒、香茅、丁香、大茴香以及肉桂精油(纯度≥95%)。

供试菌：甘薯长喙壳菌(CeratocystisfimbriataEllisetHalsted)，分离自黑斑病发病甘薯。

主要试剂：马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基、二甲基亚砜(DMSO)、草酸、盐酸、甲醇、冰醋酸、乙酸钠、愈创木酚、无水乙醇、2,6-二氯靛酚、抗坏血酸、邻苯二酚、过氧化氢、乙二胺四乙酸、聚乙二醇、交联聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇辛基苯基醚、聚乙二醇单甲醚、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾等均为分析纯。

1.2 主要设备

YP3001N电子天平，YX280B手提式不锈钢压力蒸汽灭菌器，SW-CJ-1CU双人单面(水平送风)洁净工作台，DRP-9162型电热恒温培养箱，T6新世纪可见分光光度计，HWS-250FT智能低温冷藏箱，GY-4果实硬度计，Allegra 64R Centrifuge台式高速冷冻离心机。

1.3 体外抑菌实验

1.3.1 甘薯长喙壳菌菌悬液的配制

无菌环境下，挑取适量甘薯长喙壳菌孢子于10 mL无菌水中混匀形成孢子悬浮液，用血球计数板计数，用无菌水稀释菌悬液浓度约为105CFU/mL。

1.3.2 不同植物精油对甘薯长喙壳菌的抑制活性

不同植物精油体外抑菌活性的比较采用滤纸片法[19]。将不同精油分别用DMSO充分溶解，配制成100 mg/mL的溶液。将灭菌PDA培养基倒平板(直径90 mm，高20 mm)后，分别加入0.2 mL甘薯长喙壳菌菌悬液，涂布均匀，将预先灭菌烘干的滤纸片(直径6 mm)将各精油溶液浸透并在瓶壁稍微沥干后平贴在含菌培养基上，同时设置DMSO为空白对照组。所有培养基倒置在培养箱中，在28 ℃下培养3 d，取出用游标卡尺采取十字交叉法测量滤纸片抑菌圈直径的大小，用于比较抑菌活性。所有操作在无菌条件下进行。

1.3.3 最低抑菌浓度和最小杀菌浓度的测定

采用熏蒸法[20]测定肉桂精油处理对甘薯长喙壳菌的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)和最小杀菌浓度(minimum fungicidal concentration，MFC)。将直径为30 mm的滤纸贴在培养皿的皿盖中央，与培养皿一起灭菌后备用。灭菌PDA培养基倒平板，用无菌打孔器取直径6 mm的甘薯长喙壳菌菌饼接种于PDA培养基上，分别取不同量的精油滴在滤纸中央，使精油在培养皿中的空间体积浓度分别为：20、30、40、50、60、70、80、90、100 μL/L。未加精油为空白对照组。在28 ℃培养3～5 d。以48 h内抑制率100%的最低精油浓度为MIC值，继续培养48 h，仍不长菌的精油浓度为MFC值。抑菌率=[(对照组菌落直径-精油处理组菌落直径)/(对照菌落直径-菌饼直径)] ×100%

1.4 体内抑菌实验

根据体外抑菌的结果，对健康甘薯进行人工接种致病，观察肉桂精油对甘薯黑斑病侵染的实际抑制效果。甘薯块根洗净后用75%酒精对其表面消毒、晾干，用灭菌打孔器在块根赤道部位打一个小孔(直径5 mm，深5 mm)，在无菌条件下，用灭菌一次性注射器取25 μL的浓度为105～106CFU/mL的甘薯长喙壳菌菌悬液注入孔洞，晾干，并随机将甘薯分装到4 L密封保鲜盒内。分别以空间体积浓度为0、25、40 μL/L的肉桂精油在室温下进行密封熏蒸处理24 h，于RH 85%～90%、28 ℃(长喙壳菌的适宜生长条件)恒温培养箱内贮藏。每组处理25个甘薯，且重复3次。

1.5 取样

每隔3 d取样一次，每组随机取样5个甘薯，检测甘薯失重率、病斑直径、病变深度及硬度的变化情况；并取病斑周围10 mm的薯肉用液氮冷冻粉碎后在-80 ℃条件下密封保藏，用于测定总酚含量和PPO酶活性。

1.6 甘薯病变部位相关指标检测

1.6.1 病斑直径的测定

在甘薯表面病斑处采用十分交叉法进行测量[21]，取平均值作为甘薯发生黑斑病病害的病斑直径，单位为mm。

1.6.2 病变深度的测定

从甘薯接种处横向切开，测量黑斑病在薯块组织内部的侵入深度，单位为mm。

1.6.3 失重率的测定

将贮藏甘薯定期取出称取质量，计算公式为：失重率=(贮藏前甘薯质量-贮藏后甘薯质量)/贮藏前甘薯质量×100%。

1.6.4 硬度的测定

使用GY-4果实硬度计测定，选取每个甘薯的赤道面作为测定点，取相对面的两个点作平均值为其硬度，单位为Pa。

1.6.5 总酚含量的测定

采用福林-酚法。称取1.0 g甘薯样品经液氮研磨后，加入10 mL 80%甲醇超声提取30 min，于4 ℃、12 000 g离心10 min，取上清液，4 ℃保存待测。测定过程参考Bao等[22]的方法并略作修改。总酚含量以没食子酸当量计，单位为mg/g鲜重。

1.6.6 PPO活性的测定

称取1.0 g甘薯样品，加入5.0 mL提取缓冲液(内含1 mol/L PEG、4% PVPP和1% Triton X-100)，冰浴研磨至匀浆，于4 ℃、12 000 g离心30 min，上清液即是粗酶液，4 ℃保存待测。PPO活性测定过程参考Liu等[23]的方法进行，酶活力单位分别为ΔOD420·min-1·g-1，以鲜重计。

1.7 数据统计

所有处理均重复3组，结果以平均值±SD值表示。使用IBM SPSS Statistics 23.0软件的单因素ANOVA检验对数据进行方差分析，并同时用Duncan’s比较数据之间的差异显著性，P<0.05表明各组处理之间存在显著性差异。

3 结果与分析

3.1 不同植物精油对甘薯长喙壳菌的抑制效果

抑菌圈可以反映出植物精油对甘薯长喙壳菌的抑菌活性，因此，通过抑菌圈直径大小的比较，可为筛选高效植物精油提供参考。由图1可知，在相同条件下，甘薯长喙壳菌对不同植物精油表现出不同程度的敏感性，且所选用的精油均对甘薯长喙壳菌的生长具有一定的抑制。其中，肉桂精油的平均抑菌圈直径达78.47 mm，抑制效果显著大于其他精油(P<0.05)；其次为大茴香，平均抑菌圈直径为64.37 mm，抑制效果显著大于除肉桂之外的其他精油(P<0.05)；此外，抑菌圈直径超过培养皿直径50%的精油还有山鸡椒和丁香，平均值分别是47.63mm和47.47 mm，两者对甘薯长喙壳菌的抑制效果无显著性差异(P>0.05)。迷迭香、月桂、中国薄荷和茶树精油的抑菌作用均较弱，抑菌圈直径范围为4.67～6.70 mm，不能特别有效地抑制甘薯长喙壳菌的菌丝生长。结果表明，肉桂精油对甘薯长喙壳菌表现出最强的抑制能力，抑菌效果最好。

注：不同小写字母表示不同处理组间结果差异显著(P<0.05)，余同。图1 相同浓度下12种植物精油对甘薯长喙壳菌的体外抑制效果

3.2 肉桂精油对甘薯长喙壳菌的体外熏蒸抑制效果

精油具有挥发性，熏蒸处理可使精油中的有效抑菌成分更为充分地分散在病原菌体周围，增加精油与菌体的作用表面积，能更好地发挥精油的抑菌功效[24]。不同浓度肉桂精油对甘薯长喙壳菌的体外熏蒸抑制效果如图2所示。肉桂精油的空间体积浓度越高，抑菌效果越好，这与前人的研究结果的变化趋势一致[17][25]。在培养48 h内，肉桂精油空间体积浓度≥25 μL/L时抑菌率均为100%，因此，肉桂精油的MIC浓度为25 μL/L。继续培养至96 h，30 μL/L和25μL/L的肉桂精油抑菌率均分别显著降低至90%和70%左右(P<0.05)，40 μL/L和50μL/L的肉桂精油抑菌率仍然保持在100%，因此，肉桂精油的MFC浓度为40 μL/L。

图2 不同浓度肉桂精油对甘薯长喙壳菌的体外熏蒸抑制效果

3.3 肉桂精油对甘薯贮藏期间黑斑病病斑直径的影响

如图3所示，甘薯人工接种后侵染部位的病斑直径随贮藏时间的增加呈上升趋势，精油处理组甘薯的病斑直径增加幅度在贮藏期间显著低于对照组(P<0.05)。第3天时，空白组和25 μL/L肉桂精油处理组的甘薯均已出现病害，40 μL/L肉桂精油处理组则有效抑制了病害的发生。第15天时，25、40 μL/L肉桂精油和空白组甘薯的病斑直径存在显著性差异，且空白组>25μL/L肉桂精油组>40 μL/L肉桂精油组，各处理组甘薯块根表面形成的病斑大小如图4所示。结果表明，精油熏蒸浓度越高，对甘薯长喙壳菌的入侵抑制作用越强。

注：实线折线图表示病斑直径的变化趋势；虚线折线图表示病变深度的变化趋势。图3 不同处理对甘薯病斑直径和病变深度的影响

图4 第15天时不同处理下甘薯病斑直径情况

3.4 肉桂精油对甘薯贮藏期间黑斑病病变深度的影响

甘薯病斑深度在贮藏期间的变化如图5所示。在甘薯长喙壳菌的侵染之下，精油处理组甘薯的病斑深度增加幅度在贮藏期间显著低于对照组(P<0.05)，但随着时间延长，甘薯病斑深度均呈上升趋势，与库尔勒香梨病斑深度的发展趋势一致[26]。第15天时，25 μL/L、40 μL/L肉桂精油处理组的病斑深度分别为2.5 mm和1.9 mm左右，显著低于空白组，各处理组甘薯的病变深度如图5所示，可见，肉桂精油对甘薯黑斑病对组织侵染深度的蔓延起到一定的抑制作用。

图5 第15天时不同处理下甘薯病变深度情况

3.5 肉桂精油对甘薯贮藏期间失重率的影响

甘薯贮藏期间，由于呼吸作用和蒸腾作用会加速重量损失，造成失重率增加。甘薯长喙壳菌侵染后的15 d贮藏期内，甘薯失重率的变化情况如图6所示。结果显示，甘薯的失重率随贮藏时间增加逐渐升高，40 μL/L肉桂精油处理组甘薯的失重率显著低于25 μL/L精油处理组和空白组(P<0.05)。在第15 d，空白组、25 μL/L和40 μL/L精油处理组的失重率分别达到3.0%、3.1%和1.4%，可见，40 μL/L精油处理有利于降低失重率，减少质量损失，延缓贮藏品质的下降。

注：实线折线图表示失重率的变化趋势；虚线折线图表示硬度的变化趋势。图6 不同处理对甘薯失重率和硬度的影响

3.6 肉桂精油对甘薯贮藏期间硬度的影响

硬度也是衡量果蔬采后贮藏品质的重要指标之一。甘薯长喙壳菌侵染后，甘薯的硬度变化情况如图6所示。结果显示，甘薯的失重率随贮藏时间增加呈现前期快速下降后期趋于平缓的变化趋势，40 μL/L肉桂精油对维持甘薯硬度品质的作用效果显著优于25 μL/L肉桂精油处理组(P<0.05)，且两组精油处理甘薯的硬度变化幅度均显著低于空白组(P<0.05)。可见，精油处理对于甘薯贮藏期间减缓组织的软化具有积极作用。

3.7 肉桂精油对甘薯贮藏期间总酚含量的影响

酚类是植物生长过程产生的一类次生代谢性物质，具有较强的抗氧化能力，可抑制病原菌通过伤口侵染植物组织，与植物的抗病性有直接的关系[27，28]。从图7可以看出，不同处理组甘薯的总酚含量的均呈现先上升后趋于平缓的变化趋势。甘薯长喙壳菌侵染后的第6天，总酚的含量较处理前显著提高69.0%～116.2%，此时40 μL/L精油处理组的总酚含量显著高于其余两组(P<0.05)，表明40 μL/L肉桂精油处理对增加甘薯受病菌感染后初期酚类物质的积累有一定的促进作用；在6～15 d，3组处理的甘薯总酚含量均维持在较高水平，且无显著性差异(P>0.05)。结果表明，病菌侵染有利于酚类活性物质的合成，从而减轻病情。

注：实线折线图表示总酚含量的变化趋势；虚线折线图表示PPO活性的变化趋势图7 不同处理对甘薯总酚含量的影响

3.8 肉桂精油对甘薯贮藏期间PPO活性的影响

PPO能催化多酚类物质氧化转变为有毒性的醌类物质，从而增强植物体抵御病原菌的侵入。甘薯长喙壳菌侵染后，甘薯的PPO活性变化情况如图7所示。不同处理组均呈先上升后趋于平缓的趋势，与总酚含量的变化趋势一致。与处理前相比，侵染第3天，甘薯PPO活性显著增加(P<0.05)，增加幅度30.8%～61.2%，空白组的增加幅度显著高于25 μL/L和40 μL/L肉桂精油处理组(P<0.05)，且两个精油处理之间无显著性差异(P>0.05)；之后的3～15 d PPO活性都保持比较平稳，且不同处理间无显著性差异(P>0.05)。结果表明，病菌侵染可使得PPO活性得到提高，有利于延缓病害的发展。

4 讨论

在甘薯的真菌病害中，甘薯长喙壳菌是其中最大的病原真菌，它可以从甘薯的块茎、切口等处侵染其内部，引起腐烂变质并产生毒素[29]。植物精油中具有抑制真菌的天然活性成分，且对人体健康和生态环境都不会带来负面影响[30]。不同种类的精油对特定真菌的作用效果有显著差异，通过体外和体内抑菌实验，表明肉桂精油能够有效抑制甘薯长喙壳菌的生长，作用浓度越高，对甘薯黑斑病的防控作用效果越好。已有研究表明，植物精油的主要抑菌机制是利用其疏水性使得微生物的细胞膜和脂质层被破坏，使微生物细胞的渗透性增加，胞内物质泄漏而干预微生物的正常生长[30，32]。肉桂精油能够破坏菌体细胞壁和细胞膜结构，使胞内碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)泄漏到胞外，影响能量代谢系统，最终导致菌体死亡[30]。肉桂精油成分复杂，包括醛、烃烯、酯和酮等多种化合物，以醛类为主[31, 32]，其中肉桂醛为发挥其抑菌作用的主要成分，且肉桂精油的其他成分与肉桂醛存在协同增效的作用[33]。本实验中，在相同浓度条件下，肉桂精油对甘薯长喙壳菌的体外抑制效果优于体内，因此，如果要达到相同的抑制效果，可从提高作用浓度、与其他抑菌剂复合使用方面考虑以达到相同的抑制效果。

失重率、硬度、总酚含量等指标可以用来评价果蔬采后贮藏期间的品质。失重率可反映甘薯贮藏期间物质损失和衰老的程度，本实验表明肉桂精油熏蒸处理能有效降低甘薯贮藏期间的失重率，已有研究报道，肉桂精油能推迟呼吸和乙烯高峰出现的时间，从而降低果实采后营养物质的消耗速度[34]。甘薯的干物质含量与硬度之间存在正相关，即干物质含量越高硬度越大[35]，肉桂精油在降低甘薯被病菌侵染后失重率的同时，能维持更高的硬度，延缓组织变软。酚类物质在保护植物抵抗各种生物或非生物的胁迫起着重要的作用[36]，PPO可以将酚类物质氧化为醌类物质，醌是一类比酚抗氧化能力更强的物质，能延缓入侵病原菌的生长[37，39]。实验结果表明，甘薯在接种病菌后会激发自身防御系统，提高酚类物质的积累，并在6～15 d均维持在比较高的水平，PPO活性的增加，从而使得更多的多酚类物质氧化成醌类物质，增强甘薯对长喙壳菌的抵抗力，与刘美艳等[40]研究结果一致。与空白组相比，肉桂精油熏蒸处理对甘薯贮藏期间酚类物质的合成和PPO活性的提高并无显著作用效果，但是精油处理能够有效延缓甘薯贮藏期间黑斑病的病斑直径和病斑深度的扩张，且失重率更低和组织硬度更高，这对抵制甘薯长喙壳菌的入侵和维持甘薯的贮藏品质具有积极的意义。但是，肉桂精油如何抑制甘薯长喙壳菌的生长以及如何影响甘薯采后贮藏期间的生理生化品质，在理论上还缺乏系统地探究，其作用机理有待进一步阐明。

5 结论

本研究通过体外实验，比较12种常见植物精油对甘薯长喙壳菌的抑制能力，结果表明，同样条件下，肉桂、大茴香、山鸡椒和丁香精油具有较强的抑菌活性，其中，肉桂精油的活性显著优于其他精油，MIC和MFC浓度分别为25 μL/L和40 μL/L。在此基础上，对健康甘薯进行人工接种感染甘薯长喙壳菌，采用熏蒸处理，进一步研究其对甘薯黑斑病的防控效果。结果表明，肉桂精油的体内抑菌活性不如体外作用效果，但与空白相比，肉桂精油对甘薯黑斑病的侵染程度仍具有显著的减缓作用，且40 μL/L的精油处理效果更佳，在15 d的贮藏期间，能有效减轻甘薯黑斑病的病变直径和病变深度，延缓失重率的增加和硬度的下降，并能更好地保持甘薯组织的含水量和干物质含量，且对总酚含量、PPO活性没有负面影响，结果可为甘薯采后长喙壳菌侵染导致的黑斑病防治提供技术参考。