p53 Arg72pro基因多态性与宫颈癌放化疗敏感性的相关性

张红丽 鲁亮 曹辉 方春菊 朱海振 李勇

贵州省人民医院肿瘤科（贵阳550002）

宫颈癌是发病率最高的妇科恶性肿瘤，严重影响着女性的生命健康［1］。中国的宫颈癌发病率是发达国家的6 倍，造成了严重的社会负担［2］。由于尚无特异性早期症状，超过60%的患者初诊时即诊断为局部晚期宫颈癌，同期放化疗为NCCN指南推荐标准治疗模式，但其中29%～38%的失败模式是未控或复发，而复发患者的5年生存率仅为3.8%～13%［3］。研究显示，放化疗抵抗是肿瘤未控或复发的主要原因［4］。因此，如何在治疗前预测患者对放化疗的敏感性，对于指导后续治疗显得尤为重要。

p53 基因是目前发现与人类肿瘤最相关的一种抑癌基因［5］，其在DNA 合成修复、细胞周期调控以及基因组的完整性等方面发挥着重要作用。p53 基因结构的改变已被发现与多种肿瘤的发生有关，大约50%的恶性肿瘤中发现有p53 基因的突变［6］。p53 基因72 密码子的多态性（Arg72pro，rs1042522 C ＞G）与恶性肿瘤发生的关系是近年的研究热点，目前已报道p53 Arg72pro 与胃癌［7］、乳腺癌［8］、肺癌［9］、卵巢癌［10］等发生均存在显著关联性。ROSHANI 等［11-12］研究发现p53 基因72 位密码子Arg/Arg 基因型是宫颈癌的预后风险因素。P53基因的过度表达可降低射线敏感性，且不同基因型可表现出不同的射线敏感性。本研究拟通过检测宫颈癌患者p53 Arg72pro 基因多态性与宫颈癌放化疗敏感性的关系，揭示p53 不同基因型对宫颈癌放化疗敏感性的影响。

1 资料与方法

1.1 研究对象选取贵州省人民医院肿瘤科2013年1月至2016年3月收治的宫颈癌患者105 例为研究对象，年龄为25～74 岁，平均（51 ± 10）岁。中位随访时间为6 个月。该研究已通过医院伦理委员会的批准。研究纳入标准：（1）病理组织学证实为宫颈癌；（2）FIGO 2009 分期为ⅡB⁃ⅣA 期；（3）年龄为18～80 岁；（4）ECOG 评分为0～2 分；（5）接受并完成根治性同期放化综合治疗；（6）有完整病例及随访资料者。排除标准：（1）复发或有远处转移患者；（2）放疗未完成者；（3）接受与宫颈癌治疗相关手术治疗者，但不包括介入止血、介入灌注化疗者。

1.2 治疗及随访同期放化疗期间两组患者均采用直线加速器（瑞典医科达公司设备型号：VER⁃SA HD）产生的6MV⁃X 线行图像引导下的调强放疗（IGRT），总剂量45 Gy/1.8 Gy/25 f，2 ～3 周后每周使用Ir192 高剂量率后装治疗机（荷兰核通公司 设备型号：Microselectron）腔内放疗，6 Gy×5 f，与外照射相加等效剂量为85 Gy。体外放疗和腔内放疗期间给予顺铂40 mg/m2/W（5 疗程）。

经治患者在同步放化疗后定期随访，复查影像学（两种以上影像学检查或宫颈刮片病理，有条件者可行全身PET⁃CT 检查），测量肿瘤体积改变及明确有无复发和转移。

1.3 放化治疗敏感性评估根据患者同步放化疗后4 周的疗效评价结果，将宫颈癌同步放化疗疗效分为高敏感（CR + PR）和低敏感组（PD + SD）。疗效评定标准采用实体瘤RECIST 标准（1.1 版）［13］评价疗效。

1.4 基因多态性检测采用琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA 的完整性、采用微量分光光度计检测DNA的浓度。采用PCR荧光探针法对研究对象进行SNP 位点基因分型检测，p53 Arg72pro（rs1042522）基因位点的检测均设计3 条引物，包括2 条上游引物和1 条下游引物，其中2 条上游引物均在3′端的末位根据不同的SNP 碱基给予不同的错配，共用下游引物。根据NCBI 网站上公布的DNA全序列信息，在Primer Designer 6.0 版辅助下，自行设计引物，由Life 公司合成。P53 Arg72pro 上游引物为5′⁃CCAGAATGCCAGAGGCTGCTCCCCG⁃3′，5′⁃CCAG⁃AATGCCAGAGGCTGCTCCCCC⁃3′，下游引物为5′⁃AGGAGCTGCTGGTGCAGGGGCCACG⁃3′。PCR反应体系为10 μL，PCR 反应条件为95 ℃预变性5 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火延伸30 s，循环40 次，72 ℃延伸2 min，观察结果。

1.5 统计学方法采用确切概率分析法检验Hardy⁃Weinberg 平衡；采用单因素和多因素logistic 回归分析进行放化疗敏感性影响因素筛选。所有统计学运算和制图均通过Prism 8.0（GraphPad Software，San Diego）进行。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 基因分布频率及Hardy⁃Weinberg平衡检验经SNP 检测，p53 Arg72pro C/C 基因型合计31 例，C/G基因型合计47例，G/G基因型合计27例。Hardy⁃Weinberg 平衡检验显示总体符合Hardy⁃Weinberg平衡，敏感或不敏感组患者均符合Hardy⁃Weinberg平衡（表1）。说明该群体基因可靠，具备群体代表性。

表1 p53 Arg72pro 基因分布频率及Hardy⁃Weinberg 平衡检验Tab.1 Frequency of gene distribution of p53 Arg72pro and Hardy⁃Weinberg balance test 例

2.2 基因多态性与放化疗敏感性单因素相关分析基于Codominant、Dominant、Recessive 和Over⁃dominant 的基因多态性与放化疗敏感性单因素相关分析模型显示，C/G 和G/G 的患者放化疗敏感性比例高，是保护性基因。与C/C 基因型相比，不敏感的可能性降低一半以上（0.43），但四种模型结果差异无统计学意义（P＞0.05，表2）。

2.3 与宫颈癌放化疗敏感性相关logistic 回归分析单因素logistic 回归分析结果显示Ⅲ～Ⅳ期、低分化和淋巴结转移会明显降低放化疗的敏感性（P＜0.05，表3）。经年龄、分期、分化程度、肿瘤大小及淋巴结转移等因素校正后，多因素logistic 回归结果显示：p53 Arg72pro 基因型是宫颈癌同步放化疗的独立影响因素，其中C/G 基因型显著增加了宫颈癌放化疗敏感性。

表2 p53 Arg72pro 基因多态性与放化疗敏感性单因素相关分析Tab.2 Univariate analysis for genetic polymorphism of p53 Arg72pro with chemoradiation sensitivity 例（%）

表3 影响宫颈癌放化疗敏感性的logistic 分析结果Tab.3 Logistic analysis of clinical factors for chemoradiation sensitivity

3 讨论

p53 基因在宫颈癌的发生发展过程中起到了非常重要的作用，其突变可改变靶基因转录活性、抑制凋亡、抑制放化疗敏感性以及抑制p53 家族成员（p63、p73）功能等，从而促进肿瘤进展［14］。研究发现p53 蛋白突变体可抑制DNA 双链断裂反应信号通路，增加基因组不稳定性，促进肿瘤发生。由此可见，p53 基因可作为研究肿瘤放射敏感性的一个突破口［14-15］。WANG 等［16］收集52 例宫颈鳞癌患者放疗前后活检标本，并检测p53 蛋白表达情况，发现放疗前高表达p53 蛋白的宫颈癌患者具有较差的预后，同时放疗可诱发p53 基因突变，产生稳定且有更长半衰期的p53 蛋白突变体表达，致使宫颈癌患者预后进一步恶化。而对于其具体的影响机制，有研究显示，p53 可通过乙酰化/去乙酰化调节应答射线引起的DNA 损伤等遗传毒性，进而影响放射敏感性等表型变化。

在本研究中，纳入研究的宫颈癌患者Ⅲ～Ⅳ期比例较高（23.8%），这可能说明贵州地区女性对该病知晓率不高，拖延诊治时间，致使肿瘤进展到较晚期。单因素相关性分析显示，年龄、分期、分化程度、肿瘤大小以及是否淋巴结转移等均是放化疗敏感性的相关影响因素：相比于年轻患者，年龄更长的患者对放化疗敏感度更低；相对于ⅡB 期患者，Ⅲ～Ⅳ期患者的放化疗敏感性较低；肿瘤低分化和淋巴结转移均降低了放化疗敏感性。肿瘤分期及肿瘤大小在单因素相关中发现与放化疗敏感性相关，但多因素分析中未发现与放化疗敏感性存在显著相关。这一现象说明在肿瘤分期的相关性方面掺杂了其他混杂因素造成了假性关联，这可能是由于淋巴结转移等其他因素混杂引起的。放疗和化疗联合是宫颈癌常见的治疗方式，对二者的敏感性均由不同因素控制，两者的混杂本身就给研究带来了一些复杂性。前期一些研究表明增殖活跃的细胞比不增殖的细胞对放射敏感，细胞分化程度越高放射敏感性越低，反之愈高［17-18］。在临床中笔者也发现，虽然有些患者宫颈癌已达Ⅲ～Ⅳ期，对于中、低分化及相对年轻的患者，放化疗仍然有较好的效果。大部分鳞癌属中度放射敏感，而大部分腺癌的放射敏感性与细胞的分化程度相关［19］。可见，传统的临床病理特征并不能准确反映放化疗的敏感性，对于上述某一临床病理因素相同的患者，在采用标准的同步放化疗治疗方案后，其预后仍存在有很大差别。因此，进一步丰富临床指标来评估和预测放化疗敏感性是研究热点，而p53 基因多态性就可成为潜在的评估放化疗敏感性因素。本研究中纳入的人群p53 Arg72pro基因位点检测都符合Hardy⁃Weinberg 平衡，具备群体代表性。本研究结果显示，C/G 和G/G 的患者对放化疗更敏感，属于保护性基因；而C/C 基因型则为危险基因，会降低放化疗敏感性。这与之前研究的C/C 基因型为易患癌基因有一定相似性，说明p53 Arg72pro 位点C/C 基因型不仅增加患癌风险，也对放化疗有一定抵抗。

本研究存在一定的局限性，首先，纳入分析的样本量较有限，会对分析结果造成一定的偏倚，但是本文在探究p53 基因型与放化疗敏感性关系的同时，也纳入考虑多个临床因素并进行校正，因此本文的分析结论具有一定的可靠性。同时，考虑到本研究使用疗效评价指标判定放化疗敏感性，而缺少相关实验室指标，如Fas、Fasl、Cox⁃2 等，以及p53 基因型对患者的顺铂化疗的敏感性如何尚无法明确，因此需要后续细胞及分子生化水平探究明确。其次，本研究纳入的患者局限在本院，并且大部分来自贵州地区，存在潜在的研究人群方面的选择偏倚，即对于其他地区的宫颈癌患者是否适用本研究结论，尚需要进一步探究。再次，lo⁃gistic 模型未经外部队列验证，因此，模型预测的稳健性仍需要进一步验证。