miR-214-3p通过靶向调节p53增强胃癌细胞的转移能力

周大新，谢方利，刘海科，丁 鹏，毛作周，孙 凯，俞 磊，姚卫洲，姜连春，李祥兵，刘 聪，吴丽颖

胃癌是国内发病率排名第二的恶性肿瘤，也是最常见的癌症相关死亡原因之一。早期诊断和及时手术切除为早期胃癌患者带来了良好的生存质量和较长的生存期。然而晚期胃癌，因其常经淋巴结转移以及腹膜扩散而复发，预后很差;对于晚期胃癌患者，采用以手术治疗为主，联合围手术期化疗、放疗、生物靶向治疗等手段的综合治疗，从而延长患者生存期，改善其生存质量，但治疗效果仍不理想。

目前，微小RNA(micro RNA,miRNA)在肿瘤发生发展中的作用正在受到广泛关注，众多国内外文章报道miRNA表达的改变与人类肿瘤的进展和不良预后高度相关。同样，胃癌中miRNA的异常表达也会对疾病的进程产生促进或者抑制作用。对于致癌的miRNA，用miRNA抑制剂可以有效地抑制miRNA在体内的功能；而对于肿瘤抑制性miRNA，用miRNA模拟物可起到抗肿瘤作用。因此，某些miRNA可以作为癌症诊断和治疗的靶标。该研究观察了miR-214-3p在胃癌组织中的表达情况以及对胃癌细胞转移能力的影响，并深入探索了其发生作用的分子机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

SYBR Green荧光定量PCR反应试剂盒购自北京TransGen生物公司。miRNA模拟物及抑制物由上海吉玛制药公司设计合成；p53过表达质粒由上海吉玛制药公司构建；实验所用引物及内参均由上海生工公司设计合成。Lipofect 3000转染试剂购自于美国Invirogen公司；Transwell小室及Matrigel 基质胶购自于美国Corning公司。萤光素酶报告实验检测试剂盒购自美国Promega生物公司。

1.2 临床组织标本

收集淮北市人民医院2018年12月—2020年7月经手术治疗切除的41对胃癌和对应的癌旁正常新鲜组织样本，所有病例均是本院病理确诊胃癌的病例，年龄47～71(60.26±9.71)岁，术前未经过任何放化疗治疗，样本取材后置于-80 ℃冰箱中保存所有病例均是本院病理确诊胃癌的病例。本研究取得了本院伦理委员会的批准，所有患者均签署知情同意书。

1.3 细胞分组与转染

细胞实验所使用的胃癌细胞系MGC-803购自美国ATCC公司，细胞培养方式依照该公司说明书中所述。本实验将MGC-803细胞分为NC组(转染mimic NC)、miR-214-3p上调组(转染miR-214-3p mimic)、miR-214-3p下调组(转染miR-214-3p ASO，反义寡核苷酸(Antisense oligonucleotides, ASO)，PsiCHECK2 vector+mimic NC组、PsiCHECK2-p53 3′UTR+mimic NC组，PsiCHECK2 vector+miR-214-3p mimic组，PsiCHECK2-p53 3′UTR+miR-214-3p mimic组。miRNA转染的操作按照说明书进行,，提前1 d将细胞种于6孔板中，当细胞密度达到50%左右时，使用Lipofect 3000试剂进行转染，36～48 h后进行后续细胞实验。

1.4 细胞迁移与侵袭实验

NC组、miR-214-3p下调组细胞转染36 h后，进行细胞换液，用无血清培养基饥饿培养24 h；细胞迁移实验，取细胞1×10个用300 μl无血清培养基稀释后种于小室，并在小室下方的24孔板内加入800 μl有血清培养基，置于细胞箱培养；细胞侵袭实验，提前制作基质胶60 μl并平铺于小室底部，后续方法与前述细胞迁移实验相同；待细胞迁移侵袭至小室外面，取出小室，PBS溶液清洗后，用乙醇进行细胞固定，结晶紫溶液染色，再次用PBS溶液清洗，用棉签擦去小室内面细胞，最后置于倒置相差显微镜上，并进行拍照计数。

1.5 miRNA靶基因预测

使用开放数据平台ENCORI(http://starbase.sysu.edu.cn)和TargetScan(http://www.targetscan.org)预测miR-214-3p的下游靶基因。

1.6 荧光素酶报告实验

将细胞种在24孔板中，待细胞贴壁生长后，分别将miR-214-3p mimic或mimic NC，Psicheck2-p53 3′UTR质粒或Psicheck2-Vector对照质粒转染进各组细胞，每组设置3个复孔。转染48 h后，使用萤光素酶报告实验检测试剂盒用荧光素读取板进行上机检测。

1.7 实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)

将抽提的NC组、miR-214-3p上调组、miR-214-3p下调组总RNA进行逆转录反应得到cDNA模板，加入特异性引物，使用SYBR Green荧光定量PCR反应试剂盒进行上机检测，反应结束后进行数据分析。

2 结果

2.1 miR-214-3p在胃癌组织中的表达

通过qPCR检测miR-214-3p在41对胃癌组织及其对应的癌旁正常组织中的表达水平。结果表明，癌旁正常组织miR-214-3p表达量为(6.834±3.212)，miR-214-3p在胃癌组织中的表达量为(22.107±7.215)；与癌旁正常组织相比，胃癌组织中miR-214-3p的表达上调(

P

<0.01，

t

=12.383，图1)。

图1 miR-214-3p在癌旁正常组织和胃癌组织中的表达情况 与癌旁正常组织比较：**P<0.01

2.2 miR-214-3p表达与胃癌患者临床病理特征的关系

将胃癌miR-214-3p表达量的平均值设为标准，大于平均值为高表达，小于等于平均值为低表达。通过分析miR-214-3p表达与胃癌患者临床病理特征的关系显示：miR-214-3p表达水平与胃癌患者的淋巴转移具有显著的正相关性(

P

<0.05)，而与其他特征性病理学参数包括病人患者的年龄、性别、分化程度、TNM分期、肿瘤大小均无显著相关性(表1)。

表1 miR-214-3p表达与胃癌患者临床病理特征的关系[n(%)]

2.3 miR-214-3p可调节胃癌细胞的转移能力

为了研究miR-214-3p对胃癌细胞转移能力的影响，将miR-214-3p抑制剂miR-214-3p ASO和mimic NC分别转染到MGC-803胃癌细胞系中。转染36 h后，进行细胞迁移与侵袭实验。结果表明，与NC组相比，miR-214-3p下调组细胞迁移和侵袭能力明显降低(

P

<0.05，图2)。

2.4 miR-214-3p在胃癌细胞中靶向调节p53的表达

使用开放数据平台ENCORI和TargetScan预测miR-214-3p的靶基因，并发现了p53 mRNA的3′UTR与miR-214-3p匹配的潜在结合位点(图3)。通过荧光素酶报告实验，与PsiCHECK2 vector+miR-214-3p mimic组和PsiCHECK2-p53 3′UTR+mimic NC组相比，在胃癌细胞MGC-803中同时转染miR-214-3p模拟物miR-214-3p mimic和p53 mRNA 3′UTR的Psicheck2质粒的PsiCHECK2-p53 3′UTR+miR-214-3p mimic组，荧光素酶活性受到抑制(

P

<0.05，图4)。同时，qPCR结果显示，与NC组相比：转染miR-214-3p mimic的上调组细胞，p53 mRNA的表达水平降低；而转染了miR-214-3p ASO的下调组细胞，p53 mRNA的表达水平升高(

P

<0.05，图5)。

3 讨论

在人类大多数癌症中均已报道异常的miRNA表达，而miRNA的异常表达通常与人类癌症的恶性进展和不良预后具有高度相关性。众多研究证明miRNA可促进或抑制不同的细胞过程，例如细胞凋亡、分化、发育、迁移和侵袭。

在本研究首先收集经手术治疗切除的41对胃癌及其对应的癌旁新鲜组织样本，通过qPCR检测其中miR-214-3p的表达，结果显示miR-214-3p在胃癌组织中的表达水平高于癌旁组织。Yang et al发现miR-214-3p在胃癌组织中上调，且miR-214-3p的上调与胃癌患者的不良预后密切相关。Xin et al的研究结果也显示，miR-214-3p可能通过下调PTEN来促进胃癌细胞的腹膜转移，从而导致胃癌的恶性进展。与之前的文献结果一致，miR-214-3p已被证明在多种类型的癌症的发生中起促进作用。

图2 miR-214-3p调节胃癌细胞迁移和侵袭能力 ×200 与NC组比较：*P<0.05

图3 miR-214-3p与p53 mRNA的3′UTR匹配结合位点

图4 荧光素酶报告实验检测 胃癌细胞MGC-803中miR-214-3p对p53 mRNA 3′UTR的作用

图5 qPCR检测胃癌细胞MGC-803中转染 miR-214-3p mimic或miR-214-3p ASO后 p53 mRNA的表达水平

本实验通过在胃癌细胞MGC-803转染miR-214-3p ASO，并进行细胞迁移与侵袭实验，实验结果显示抑制miR-214-3p的表达可以降低胃癌细胞的转移能力。这与Orso et al在乳腺癌中报道的相同，miR-214-3p上调导致乳腺癌和黑色素瘤细胞转移能力的增强，从而最终促进癌症的发展。但在不同的癌症中，miR-214-3p对肿瘤发生发展的作用可能是不同的。有文献显示miR-214-3p也可以起到抑癌的作用，Sun et al通过体外细胞实验表明miR-214-3p可通过靶向BCL-9L来抑制结肠癌细胞的增殖，转移和上皮-间质转化。

本研究预测到p53 mRNA的3′UTR中存在一个保守的miR-214-3p结合位点。此外，荧光素酶报告实验测定的结果表明，当用PsiCHECK2-p53 3′UTR转染细胞时，miR-214-3p mimic的过表达降低了荧光素酶的活性，而用PsiCHECK2-Vector转染时则没有降低荧光素酶的活性，该结果说明p53是miR-214-3p的直接靶标。与该研究结果一致，Wang et al在骨髓瘤肿乳腺癌中发现p53是miR-214-3p的靶基因。p53作为一种著名的抑癌基因，在几乎所有人类恶性肿瘤中产生突变或沉默，这成为肿瘤发生发展中的关键因素。p53主要通过控制细胞周期、凋亡和DNA修复在维持基因组完整性方面的重要作用而闻名。最近，Kong et al报道lncRNA ZFPM2-AS1可以通过稳定巨噬细胞迁移抑制因子来减弱p53途径并促进胃癌发生。因此，为了研究胃癌细胞中miR-214-3p对p53的调控作用，本研究在胃癌细胞MGC-803中转染miR-214-3p mimic和miR-214-3p ASO，通过qPCR结果分析显示，过表达miR-214-3p可使p53 mRNA的表达水平降低，抑制miR-214-3p的表达可使p53 mRNA的表达水平增高。以上结果表明miR-214-3p的上调可以通过抑制p53的表达，从而增强胃癌细胞的迁移与侵袭能力。

综上所述，本研究表明miR-214-3p在胃癌中的表达上调，提示miR-214-3p可以作为临床胃癌的一个辅助诊断标志物。miR-214-3p ASO可以抑制胃癌细胞的迁移与侵袭，因此，基于miR-214-3p的抑制剂可以被用作胃癌的潜在治疗药物。miR-214-3p靶向调控抑癌基因p53的表达，从而增强胃癌细胞的迁移与侵袭能力，进一步揭示了胃癌中miR-214-3p发挥促癌作用的机制。因此，这项研究为胃癌细胞的发病机制提供了新颖的见解，并提示miR-214-3p可作为胃癌治疗的潜在治疗靶标。