小檗碱调节ERK/NF-κB信号通路改善高糖诱导的系膜细胞异常增殖

胡亚琴，汪佳佳，吴 昊，刘 青，唐丽琴,2，魏 伟

糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)被认为是造成终末期肾脏功能衰竭的主要原因之一。DN的主要病理变化是肾小球系膜细胞(mesangial cells, MCs)异常增殖,肾小球系膜基质扩张和基底膜增厚，MCs的异常增殖是导致肾小球系膜基质增加和细胞外基质(extracellularmatrix, ECM)沉积增加的重要原因，而Ⅳ型胶原蛋白(collagen Ⅳ, Col-Ⅳ)和纤维连接蛋白(fibronectin, FN)是ECM的主要成分。研究表明，细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)在调节细胞的增殖、分化过程中具有重要作用。促分裂原激活激酶1(mitogenstress activated kinase 1, MSK1)是ERK的下游激酶，可诱导核转录因子kappa B(nuclear factor kappa B, NF-κB)的激活。小檗碱(berberine, BBR)具有抗氧化活性、调节血脂和减轻炎症等多种药理作用。课题组前期研究表明，BBR可能在抑制肾小球MCs的增殖和分泌中起重要作用。该研究通过探讨BBR能否调节ERK/NF-κB信号通路改善高糖诱导的MCs的异常增殖，进一步研究BBR对DN的药理作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1

细胞

小鼠MCs株(147589)购自中科院上海细胞库。

1.1.2

药物

BBR(BW 50137)购自北京北纳创联生物技术研究所，纯度为98.37%(液相色谱法)。配置方法：称量BBR粉末20.182 5 g，加入5 ml生理盐水，并通过加热和超声处理使其完全溶解，得到终浓度为1.2×10μmol/L的BBR母液，采用0.22 μm无菌滤器除去细菌后-20 ℃存放。使用前水浴加热，使其溶解后，稀释数倍至所需浓度即可。

1.1.3

试剂

CCK-8试剂盒购自日本同仁化学研究所；DMEM培养液购自美国Hyclone公司；胎牛血清购自以色列Biological Industries公司；青霉素-链霉素溶液、胰酶、一抗稀释液、二抗稀释液，DAPI 染液及防荧光淬灭剂购自上海碧云天生物技术研究所；6孔细胞培养板购自无锡NEST公司；鼠源FN购自武汉Proteintech公司；兔源Col-Ⅳ购自英国Abcam公司；兔源ERK、p-ERK购自美国affinity公司；IκB、p-IκB、p65、p-p65购自美国Cell Signaling Technology公司。

1.1.4 仪器

电泳仪购自北京六一仪器厂；SW-CJ-1F 超净工作台购自苏州苏净集团安泰公司；BioTek Elx×808 酶标仪购自美国BioTek 公司；激光共聚焦显微镜购自德国莱卡公司；Image Xpress Micro 4 型高内涵细胞成像系统购自美国Molecular Devcies 公司；ImageQuant LAS 4000荧光及化学发光成像系统购自美国GE Healthcare Life Sciences公司。

1.2 细胞培养

从液氮中取出冻存细胞，在37 ℃水浴中解冻并离心，使用含有10% FBS和1%双抗的DMEM低糖完全培养基培养细胞，在5% CO和37 ℃的培养箱培养细胞。

1.3 细胞活力

CCK-8法检测处于指数生长期的MCs，将100 μl/孔的MCs单细胞悬液(约10个细胞)铺于96孔培养板中，每组另设立5个平行对照组；待细胞完全贴壁后，分为对照(Control, 11.1 mmol/L葡萄糖)组，高糖(high gloss, HG)模型(HG，30 mmol/L葡萄糖)组和BBR给药组(30、60、90 μmol/L)。给药24 h后，每孔加入10 μl CCK8溶液后，避光孵育，每隔30 min使用酶标仪测定每组在450 nm处的吸光度。取各组实验的平均值，重复3次实验。

1.4 高内涵细胞成像法检测细胞增殖

将100 μl/孔的MCs单细胞悬液(约10个细胞)铺于96孔培养板中，每组另设立5个平行对照组；待细胞贴壁完全后，分为Control组、 HG组和BBR给药组(30、60、90 μmol/L)。给药24 h后，使用PBS将细胞清洗2遍后，多聚甲醛固定30 min, 每孔加入20 μl的DAPI溶液染色5 min，弃DAPI染色液，加入PBS后，使用高内涵细胞成像系统可以完整拍摄整孔细胞，每孔拍摄25张图片。细胞数统计：测量图片中细胞核直径的最大与最小值，设定细胞核直径的识别范围；测量细胞核荧光强度的最大与最小值，减去背景荧光强度，设定荧光强度的识别范围，通过此两个标准统计细胞总数，选择模块以分析细胞总数并将结果导出至 Excel表格。

1.5 激光共聚焦法检测FN和Col-Ⅳ的表达

用胰酶消化细胞后，对细胞进行计数，将500 μl/孔的MCs单细胞悬液(约10个细胞)铺于含有盖玻片的24孔板内，待细胞贴壁，分为Control组、HG组和BBR给药组，细胞培养24 h后，弃去培养基，使用PBS清洗3遍，每次5 min，弃去PBS；4%多聚甲醛室温下固定细胞30 min后， PBS清洗细胞3遍，每次5 min，弃去PBS；5% BSA室温下封闭30 min后， PBS清洗细胞3遍，每次5 min，弃去PBS；一抗(1 ∶100) 4 ℃过夜；回收一抗后， PBS清洗细胞3遍，每次5 min，弃去PBS；加入荧光二抗200 μl，室温下避光孵育1 h后， PBS清洗3遍，每次10 min，弃去PBS；加入DAPI染液200 μl染核10 min后， PBS清洗细胞3遍，每次10 min，弃去PBS；将盖玻片放置平面上，待其干后，将防荧光淬灭剂滴在载玻片上进行封片，盖玻片四周涂上指甲油用来密封。使用激光共聚焦显微镜对细胞观察拍照。

1.6 Western blot检测相关蛋白表达

取对数生长期细胞，将 2 ml/孔的MCs单细胞悬液(约10个细胞)接种于6孔板中，处理同“1.3”项，培养24 h后，使用PBS清洗2遍，弃去PBS，现配RIPA加PMSF后，使之充分裂解后，收集上清液，使用BCA测定蛋白浓度。将蛋白上样缓冲液加入到蛋白样品中，100 ℃水浴10 min，然后完成上样，跑胶、转膜、封闭等步骤，用目的蛋白抗体4 ℃孵育过夜，使用TPBS洗膜3次后，用适宜浓度的二抗工作液37 ℃孵育2 h，显影后使用灰度图分析得出结果。

2 结果

2.1 BBR对MCs增殖活力的影响

CCK-8结果显示(图1)，与Control组相比，HG能增加MCs增殖活力(

P

<0.01)；与HG组相比，BBR给药组(30、60、90 μmol/L)均能降低MCs增殖活力。

图1 BBR对HG诱导的系膜细胞活力的影响

2.2 BBR对MCs增殖能力的影响

高内涵结果显示(图2)，与Control组相比，HG能增加MCs数量(

P

<0.01)；与HG组比较，BBR给药组(30、60、90 μmol/L)均能抑制MCs的异常增殖。

图2 BBR对HG诱导的系膜细胞增殖的影响 与Control组比较：##P<0.01；与HG组比较：*P<0.05,**P<0.01

图3 BBR对FN和Col-Ⅳ的表达水平影响的 ×400

2.3 BBR对FN和Col-Ⅳ表达的影响

激光共聚焦结果显示(图3)，与Control组相比，HG组的FN和Col-Ⅳ的表达升高；与HG组比较，BBR给药组(90 μmol/L)的FN和Col-Ⅳ的表达降低。

2.4 BBR对MCs上ERK/NF-κB蛋白表达水

平的影响

ERK/NF-κB信号通路是参与细胞异常增殖的重要调节因子。Western blot结果显示(图4)，与Control组相比，HG组中MCs上p-ERK、p-MSK1、p-IκB和p-p65蛋白表达水平升高(

P

<0.01)，BBR给药组(30、60、90 μmol/L)能够有效降低MCs上p-ERK、p-MSK1、p-IκB和p-p65蛋白表达水平。

图4 BBR对ERK/NF-κB信号通路相关蛋白的的影响

3 讨论

DN被认为是糖尿病的主要微血管并发症之一，也是造成终末期肾脏功能衰竭的主要原因。研究表明，DN主要是由于非酶促造成糖化、氧化应激、肾血流动力学变化、血脂异常、高血压、蛋白激酶激活、血管活性物质等因素造成的。肾小球系膜区由MCs和其自身分泌的细胞外基质共同组成，对维持肾小球毛细血管网发挥了重要的支撑作用。此外，MCs具有一定的收缩功能，可通过调节细胞的收缩与舒张来参与肾小球的血流供应，具有维持系膜基质稳态和滤过作用。因此，MCs在维持肾小球正常功能中发挥了重要作用。在DN的病理发展过程中，MCs的异常增殖在早期肾肥大和晚期肾小球硬化中起了关键作用。研究显示，多种刺激对MCs的增殖反应都与DN的发生及发展有关，其中高糖是MCs异常增殖的最有效刺激。高糖刺激MCs后，将会导致MCs的异常增殖和ECM，从而导致肾小球基底膜增厚以及肾小球系膜区基质沉积，最终导致肾小球硬化。在本次实验中，用30 mmol/L葡萄糖成功刺激MCs 24 h后，检测显示与Control组比较，HG组MCs个数增多，细胞增殖活力增强，MCs发生异常增殖，MCs上的FN和Col-Ⅳ的表达水平升高。

研究表明丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)作为真核细胞胞质内的信号转导终末通路，与DN的发病机制密切相关，而ERK是最具代表性的MAPK之一。在DN模型中发现，阻断ERK通路后导致MCs增殖减少，这表明了ERK在保护MCs中的重要作用。此外，在人类肾小球病变中，ERK通路的激活参与了细胞增殖、组织学病变和肾功能不全。在高糖刺激后，将导致ERK的一连串的磷酸化，使ERK1和ERK2的2种同工型的Thr-Glu-Try基序双重磷酸化。ERK的磷酸化形式是一种活性激酶，可以使包括NF-κB在内的许多转录因子磷酸化。在细胞中，NF-κB转录因子由于抑制蛋白(包括IκBα、IκBβ、IκBε和IκB)保留在胞质中。刺激后，IKKs在32和36个丝氨酸残基处都将IκBα抑制蛋白磷酸化，从而发生泛素化和蛋白酶体降解，随后导致NF-κB从细胞质到核的核易位，入核的NF-κB与基因启动子的调节区结合，并参与炎症基因的表达。

BBR目前已广泛应用于治疗胃肠炎和分泌性腹泻等疾病。研究表明，BBR具有如抗氧化应激、抗炎、抗微生物和抗癌等广泛的药理活性，在DN进展中发挥了重要的肾脏保护作用。本研究通过在体外使用HG刺激MCs，同时使用不同浓度的BBR治疗，来观察BBR抑制MCs异常增殖的药理机制，通过检测MCs的细胞增殖活力、增殖能力、MCs上相关蛋白的表达水平，可知BBR在高糖环境下可以抑制MCs的异常增殖，减少ECM，并且可以有效调节高糖环境下MCs上ERK/NF-κB信号通路的表达，从而抑制MCs的异常增殖。

综上所述，本研究提示HG能促进MCs的异常增殖与ECM沉积，而BBR能明显逆转此过程，其机制可能与调节MCs上ERK/NF-κB信号通路的活化有关。