丁酸钠、Hemin及DMSO诱导K562红系分化作用的差异

刘 含，杨红兰，莫 晶，张 鹏，范安然，何志旭

K562细胞最初源于一位慢性髓系白血病患者的腹水，该细胞内蛋白表达与胚胎期红系祖细胞相近，是分析红白血病耐药性及γ-珠蛋白表达调控的常用细胞系。国内外大量体外实验研究均显示，K562不仅可以被诱导向红系分化，还能在佛波酯诱导作用下向单核巨噬细胞系分化。以上实验数据表明K562在体外相对于造血干细胞是更易研究红系相关疾病发病机制的体外实验载体。丁酸钠、Hemin及DMSO处理K562的作用效果均有较多的研究和报道，但这3种化合物对反映红系分化指标的作用差异却少有报道。该实验旨在检测化学试剂丁酸钠、Hemin及DMSO在诱导K562红系分化过程中，对细胞增殖、细胞周期、TMB染色阳性率以及红细胞分化抗原CD235a表达量的不同影响。进一步综合评价丁酸钠、Hemin及DMSO之间诱导K562红系分化最佳的试剂，以期节省体外K562红系分化诱导过程中选择诱导试剂的时间，为红系系统疾病如：地中海贫血，镰刀状细胞贫血，血红蛋白异常综合征等发病机制研究及药物治疗等体外研究提供实验参考。

1 材料与方法

1.1 材料

K562(武汉普诺赛公司)；Hemin、DMSO(北京索莱宝科技有限公司)；丁酸钠、TMB(美国Sigma公司)；RPMI 1640培养液(美国Invitrogen生命技术有限公司)；PBS、双抗(以色列Biological Industries公司)；30% HO、冰醋酸(重庆川东化工有限公司)；NaOH(重庆江川化工有限公司)；HCl(天津科密欧化学试剂有限公司)；Quick-RNA miniprep plus(美国Zymo Research公司)；PI/RNase Staining Buffer(美国BD公司)；Donkey anti mouse 488(美国Thermo Fisher scientific公司)。

1.2 细胞培养与冻存

K562完全培养基成分为：RPMI 1640+10% FBS+1%双抗；培养箱环境为37 ℃，5% CO。丁酸钠、Hemin及DMSO的工作浓度分别为1.5、20 μmol/L及2%，于6孔板中培养并每24 h连续培养换液120 h。K562细胞冻存条件为90%完全培养基+10% DMSO。

1.4 TMB染色

称取TMB 5 mg，加入12.5 ml 1%冰醋酸并混匀，4 ℃避光保存。每24 h收集部分细胞并用PBS洗涤，而后新鲜配制1 ml TMB+5 μl 30% HO混合液，加入与细胞悬液等体积的染液，混匀后转移至24孔板中，避光染色5 min。于×400下按“右下右上”的方向计数200个细胞中胞质成蓝色的细胞数量，计算成百分率。

1.5 流式细胞仪检测细胞周期

收集细胞并用PBS洗涤，将细胞沉淀用75%冰乙醇重悬，4 ℃保存16 h，离心并用PBS洗涤细胞2遍，而后用100 μl PI染液重悬避光染色10 min，分批染色保证样本之间染色时间相同。经200目筛过滤后上机检测细胞周期。

1.6 流式细胞仪检测CD235a的表达

收集药物处理120 h的细胞，分为DMSO处理、丁酸钠处理、Hemin处理、空白对照及单染二抗对照组。收集细胞并用50 μl PBS重悬，与50 μl含有0.5 μg CD235a的一抗稀释液混匀，冰上孵育1 h，PBS洗涤2遍后，用配好的100 μl Donkey anti mouse 488(1 ∶200)重悬细胞，避光冰上孵育1 h。PBS洗涤并重悬，200目筛过滤后上机检测。

2 结果

2.1 丁酸钠、Hemin及DMSO对K562细胞增殖的影响

K562在添加有丁酸钠、Hemin及DMSO的培养液中连续培养120 h，结果显示，相比于空白对照组，丁酸钠处理组K562的细胞数量持续受到抑制作用；DMSO处理组于48～72 h对K562细胞增殖表现为抑制，但处理96～120 h的细胞与空白对照组细胞数量差异无统计学意义。Hemin处理组细胞增殖与对照组差异无统计学意义。药物暴露120 h后，丁酸钠、Hemin、DMSO处理及空白对照组细胞数量分别为(1.72±0.15)×10个、(5.08±0.54)×10个、(4.83±0.8)×10个及(5.63±0.14)×10个，

F

=105.4。如图1所示，丁酸钠、Hemin及DMSO对K562细胞增殖的抑制程度排序：丁酸钠处理组>DMSO处理组>Hemin处理组≈空白对照组。

图1 丁酸钠、Hemin及DMSO处理K562后对细胞增殖的影响 与空白对照组比较：*P<0.05

2.2 丁酸钠、Hemin及DMSO对K562细胞周期的影响

收集48、72 、96 及120 h丁酸钠、Hemin及DMSO诱导的K562细胞进行细胞周期检测。图2显示Hemin处理的K562细胞周期相较空白对照组差异无统计学意义。当K562暴露于丁酸钠48～72 h时，其细胞周期较空白对照组于G0/G1期比例增高；而随着暴露时间的延长，处理96～120 h的细胞相对于空白对照组于G2/M期比例增高。与此同时，DMSO处理后K562细胞周期阻滞于G0/G1期。G0/G1期与空白对照组相比：

F

(48 h)=8.674；

F

(72 h)=37.82；

F

(96 h)=16.55；

F

(120 h)=32.81；G2/M期与空白对照组相比：

F

(96 h)=9.793；

F

(120 h)=24.53。

2.3 丁酸钠、Hemin及DMSO对K562细胞TMB阳性率的影响

TMB染液可与胞内的血红蛋白发生氧化还原反应，阳性染色呈深蓝色。如图3A所示，通过观察120 h各组TMB染色阳性情况，可见Hemin和丁酸钠处理后的细胞TMB阳性率高于空白对照组。每24 h收集部分细胞进行TMB染色，统计结果如图3B所示：相较于空白对照组，除DMSO处理组细胞TMB阳性比率从24～120 h均与空白组差异无统计学意义外，丁酸钠和Hemin处理后，K562的TMB阳性率48～120 h均高于空白对照组。药物暴露120 h后，丁酸钠、Hemin、DMSO处理及空白对照组TMB阳性率分别为(22.02±2.27)%、(90.83±2.69)%、(1.84±0.48)%及(2.89±0.18)%，

F

=1 641。

2.4 丁酸钠、Hemin及DMSO对K562细胞CD235a表达的影响

收集丁酸钠、Hemin及DMSO处理120 h后的细胞，洗涤并进行CD235a染色，分别设置处理组包括丁酸钠、Hemin及DMSO；空白对照及单染二抗对照组，重复3次实验，选取其中1次，结果如图4所示。DMSO处理组的CD235a较空白对照组差异无统计学意义；丁酸钠和Hemin处理后，K562中CD235a表达水平均较空白对照组升高，且两处理组间差异无统计学意义。

3 讨论

国内外大量研究显示K562细胞具有向红系和单核巨噬系分化的潜能。20世纪70年代研究表明,丁酸钠、Hemin及DMSO被证明可诱导K562向红系分化，但是这些化学试剂诱导得到的红系细胞质量和诱导效率等存在一定的差异。本研究通过分析丁酸钠、Hemin及DMSO对反映K562细胞红系分化效率指标的作用差异，综合比较这3种试剂中诱导K562红系分化效率较好的试剂，为之后红细胞分化的实验奠定基础。

Hemin的化学结构显示其分子内部含有一个Fe，常被临床用作补铁剂。红细胞分化发育过程中，铁离子是红细胞合成血红蛋白必不可少的离子，K562培养液中Hemin的加入从外源大幅提高了血红蛋白合成的原料，这可被认为是其诱导K562红系分化的原理之一。同时有研究表明Hemin在诱导红系分化过程中，对细胞分化具有重要作用的分子G蛋白和磷酸化的ERK表达水平的升高。随着Hemin处理时间的延长，胎儿血红蛋白的表达量往往呈上调变化。然而这种作用在去除诱导剂后便恢复到未诱导之前的状态，呈可逆性。本实验结果显示Hemin处理后K562细胞TMB阳性比率较空白对照组高。但受Hemin自身化学性质的影响，可能导致TMB阳性比率假性升高。为了克服这种问题，本研究通过使用红系表面标记CD235a进一步检测诱导后的红细胞分化比例。CD235a是用来区分红系祖细胞和红系终末期细胞常用的红系细胞表面标志物。随着K562向红系分化发展，其表面的CD235a表达也会随之增高。本研究发现，Hemin处理K562细胞后，CD235a阳性细胞比率均高于空白对照组和DMSO组。并且实验结果显示Hemin的处理并不影响细胞增殖和细胞周期。以上结果表明Hemin可有效的诱导K562向红系分化。

图2 丁酸钠、Hemin及DMSO处理120 h对K562细胞周期的影响

图3 丁酸钠、Hemin和DMSO处理K562后TMB阳性率的变化

图4 丁酸钠、Hemin及DMSO对K562细胞CD235a表达的影响

除Hemin外，DMSO也被报道可诱导K562向红系分化。但是，本研究通过TMB染色和CD235a染色发现，DMSO的处理并不能大幅增加红系细胞的比例。且在诱导过程中，DMSO可以改变细胞周期。因此，DMSO在K562细胞诱导红系分化中并不是非常好的选择。

丁酸钠是一种短链脂肪酸，具有抑制组蛋白去乙酰基酶发挥作用的特性，可促进K562向红系分化。丁酸钠诱导K562红系分化的作用机理不仅依靠自身特性，作用于γ-珠蛋白启动子区使其乙酰化程度升高，同时有研究显示丁酸钠还可通过激活p38 MAPK信号途径促进γ-珠蛋白启动子区乙酰化程度。本研究通过TMB染色和CD235a表面标记染色显示丁酸钠能够有效的促进K562细胞向红系分化，但在丁酸钠处理过程中可能通过改变细胞周期，从而对细胞增殖具有抑制作用。因此，在需要获得大量的诱导的红系细胞的实验中，丁酸钠也不是非常好的选择。