Toll样受体2和相关炎症因子在金黄色葡萄球菌致慢性骨髓炎中的作用

王馥香， 徐东克， 王成昆， 李 静， 杨 杰

骨髓炎是由于创伤、局部缺血或异物的存在，引起大量细菌的侵袭所致的进行性炎症反应[1-2]。抗菌治疗和外科清创术是骨髓炎治疗的主要方式[3]。但这些方式可能会延长患者住院时间，并且增加患者的医疗费用。尽管外科手术和药物治疗取得了相当大的进展，但骨髓炎的治疗仍十分困难，临床治疗时需综合考虑宿主因素和解剖因素，这对外科治疗和药物治疗均提出了挑战。本研究探究分析了Toll样受体2（TLR2）和相关炎症因子在金黄色葡萄球菌感染所致的慢性骨髓炎发展中的作用，为后期进一步探究骨髓炎的发病机制，并研发金黄色葡萄球菌所致慢性骨髓炎的针对性药物提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 一般临床资料

收集2015年5月—2019年7月，至南阳医学高等专科学校第一附属医院治疗的金黄色葡萄球菌感染所致慢性骨髓炎患者60例，作为研究组。同时收集60例健康体检者，作为对照组。研究组患者年龄30～60岁，平均（45.5±5.5）岁。对照组年龄29～58岁，平均（46.2±4.5）岁。两组入选者一般资料差异无统计学意义。纳入标准：①年龄25～60岁；②患者均表现局部疼痛、红肿和窦道形成，并经X线摄片诊断为慢性骨髓炎，并取伤口分泌物进行致病菌培养和鉴定，确诊为金黄色葡萄球菌感染；③无其他重大疾病；④意识清晰，自主签署知情同意书。排除标准：①急性/亚急性骨髓炎；②患有其他重大疾病；③临床数据不全或治疗后失联；④无法自主签署知情同意书。

小鼠MC3T3-E1细胞购自上海中科院细胞库。标准菌株金黄色葡萄球菌ATCC 25923由本院检验科提供。

1.2 方法

1.2.1 ELISA法检测蛋白表达水平 使用人TLR2检测试剂盒（上海信裕生物科技有限公司，中国）检测受检者血清和细胞上清液中的TLR2水平。使用人白细胞介素-6（IL-6）检测试剂盒（北京方程生物，中国）检测受检者血清和细胞上清液中的IL-6水平。使用人肿瘤坏死因子-α（TNF-α）检测试剂盒（北京方程生物，中国）检测受检者血清和细胞上清液中的TNF-α水平。

1.2.2 Western blot检测蛋白表达水平 进行10%的SDS-PAGE电泳，转膜后使用5%脱脂奶粉-PBS孵育PVDF膜1.5 h，然后使用相应一抗于4℃孵育过夜，次日使用对应二抗孵育1 h，然后使用超敏ECL化学发光试剂盒（碧云天，中国）显影。

1.2.3 RT-PCR法检测mRNA水平 采用Trizol法提取细胞总RNA，使用一步法RT-PCR试剂盒（上海联迈生物工程有限公司，中国）进行RTPCR检测TLR2 mRNA水平，所用正向引物为“5’-CACTGGGGGTAACATCGCTT-3’”,反 向 引物为“5’-GCTGACTTCACTACGGGCA-3’”。

1.2.4 流式细胞仪测定细胞凋亡 使用Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒（Invitrogen，USA）检测细胞凋亡。使用流式细胞仪（FACSCalibur，BD Bioscience USA）对样品进行凋亡测定，并使用Flowjo软件分析各组细胞凋亡率。

2 结果

2.1 慢性骨髓炎患者血清TLR2表达和炎症因子水平

比较研究组患者和对照组血清TLR2表达和炎症因子IL-6和TNF-α水平。与健康体检者相比，慢性骨髓炎患者血清TLR2、IL-6和TNF-α水平均显著升高（P＜0.05）。见表1。

2.2 金黄色葡萄球菌感染促使细胞凋亡

使用80 MOI金黄色葡萄球菌感染小鼠MC3T3-E1细胞，在感染前（0 h）和感染后6 h、12 h、24 h、36 h和48 h检测细胞凋亡情况，并设置未感染的小鼠MC3T3-E1细胞为未感染组。

表1 慢性骨髓炎患者血清TLR2表达和炎症因子水平Table 1 Serum levels of TLR2 and inflammatory factors in patients with chronic osteomyelitis

流式细胞检测结果显示金黄色葡萄球菌感染显著促使小鼠MC3T3-E1细胞凋亡，且与时间呈正相关。感染12 h时，感染组细胞凋亡比例 （19.5%）显著高于未感染组（2.6%），P＜0.05，且在48 h时，感染组细胞凋亡比例达到50.5%，显著高于未感染组（3.5%），P＜0.05。此外，金黄色葡萄球菌感染后，细胞促凋亡基因bax表达水平显著升高，抗细胞凋亡基因bcl-2表达量显著下降，且表现出时间依赖性，进一步证实了金黄色葡萄球菌对小鼠MC3T3-E1细胞凋亡的影响。见图1。

图1 金黄色葡萄球菌感染促使细胞凋亡Figure 1 Staphylococcus aureus infection promotes cell apoptosis

2.3 金黄色葡萄球菌感染时TLR2和炎症因子的变化

分别检测经80 MOI金黄色葡萄球菌感染前和 感 染 后6 h、12 h、24 h、36 h、48 h的 小 鼠MC3T3-E1细胞的TLR2 mRNA和蛋白表达水平，以及炎症因子IL-6和TNF-α的表达。

金黄色葡萄球菌感染细胞后，显著提高了TLR2 mRNA和蛋白表达水平（P＜0.05），见图2，并促进了炎症因子IL-6和TNF-α的表达（P＜0.05），见图3。

2.4 抑制 TLR2 可降低金黄色葡萄球菌诱导的IL-6 和 TNF-α 表达

为探究TLR2在金黄色葡萄球菌感染中所起的作用，实验使用TLR2阻断抗体孵育80 MOI金黄色葡萄球菌感染的小鼠MC3T3-E1细胞，并设置未处理组作为对照。处理24 h后，检测细胞的TLR2 mRNA和蛋白表达水平，比较两组细胞中的TLR2 表达水平变化。

经TLR2阻断抗体处理的细胞中的TLR2 表达水平显著低于未处理组（P＜0.05），见图4。同时，发现IL-6 和 TNF-α表达水平也显著低于未处理组（P＜0.05），见图5。

图2 金黄色葡萄球菌感染增强细胞TLR2 mRNA和蛋白的表达Figure 2 Staphylococcus aureus infection enhances the expression of TLR2 protein in cells*P < 0.05 compared with the baseline level before infection. TLR2, Toll-like receptor 2.

图3 金黄色葡萄球菌感染促进TNF-α和IL-6的表达升高Figure 3 Staphylococcus aureus infection stimulates the expression of TNF-α and IL-6

图4 TLR2阻断抗体处理抑制金黄色葡萄球菌诱导的细胞TLR2 表达Figure 4 TLR2 blocking antibody treatment inhibits the expression of TLR2 induced by Staphylococcus aureus in cell experiments

图5 抑制 TLR2 降低金黄色葡萄球菌诱导的IL-6 和 TNF-α表达Figure 5 Blocking TLR2 reduces the expression of IL-6 and TNF-α induced by Staphylococcus aureus

3 讨论

慢性和复发性感染是临床的严重问题，特别是骨组织的细菌感染,更倾向于演变成慢性病，增加治疗难度[4]。根据细菌感染骨组织的途径，可以将不同类型的骨髓炎进行分类，例如血肿性骨髓炎，这是由于创伤后局部感染的持续蔓延或足部溃疡引起的[5]。所有不同类型的骨髓炎均可发展为慢性和复发性病程，在感染后数周至数月仍有症状。金黄色葡萄球菌是临床骨髓炎中最常见的致病菌之一。本研究发现在金黄色葡萄球菌所致慢性骨髓炎中，患者血清TLR2水平和炎症因子（IL-6、TNF-α）水平均显著升高。

为了进一步探究TLR2所起的作用，研究使用金黄色葡萄球菌感染小鼠MC3T3-E1细胞，发现金黄色葡萄球菌感染对小鼠MC3T3-E1细胞凋亡的诱导作用显著，并显著提高了TLR2 mRNA和蛋白表达水平,促进了炎症因子IL-6和TNF-α的表达。

TLR信号传导是启动针对人类和动物中入侵微生物的宿主免疫防御机制的研究最充分的途径之一[6]。TLR是先天性和适应性免疫的重要介质，可对多种微生物配体和宿主在感染过程中产生的“危险信号”做出反应[7-8]。已有的研究数据表明，表达的TLR具有诱导细胞炎症因子和趋化因子的产生，或激活下游信号转导（NF-kB、p38和ERK）的功能[9-10]。本研究为证实在金黄色葡萄球菌感染中TLR2对炎症因子IL-6和TNF-α的调控作用，采用了TLR2阻断抗体处理感染后的细胞，结果发现TLR2 蛋白的减少显著降低了IL-6和TNF-α的表达。

综上所述，本课题探究了TLR2在金黄色葡萄球菌所致骨髓炎发展中所起的作用，证实在金黄色葡萄球菌所致的慢性骨髓炎患者中血清TLR2、IL-6和TNF-α水平都显著升高，同时在细胞实验中证实TLR2在诱导细胞凋亡中起的作用，并在这一过程中TLR2的表达调控细胞炎症因子IL-6和TNF-α的表达，且呈正反馈作用，为进一步探究骨髓炎的发病机制，研发针对性药物提供了理论基础。