阿仑膦酸钠联合辛伐他汀通过Wnt/β-catenin信号通路对去卵巢骨质疏松大鼠的影响

朱忠华 唐丽琴 张世能

1.黄山市人民医院药剂科，安徽 黄山 245000 2.中国科学技术大学附属第一医院药剂科，安徽 合肥 230000 3.黄山学院教务处，安徽 黄山 245000

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是以低骨量、骨微结构退化，骨强度降低、骨脆性及骨折危险性增加为特征的一种全身性骨骼疾病[1]。OP的发生是骨形成和骨吸收的骨重建进程失衡，涉及调控成骨细胞和破骨细胞平衡失调的一系列细胞因子和信号分子的影响[2]。Wnt/β-catenin信号通路在骨形成和骨代谢过程中发挥关键性作用，经典Wnt信号通路激活，可诱导成骨细胞的增殖和分化，增强成骨细胞矿化活性，增加骨密度和骨强度，同时抑制成骨细胞凋亡，另外间接影响破骨细胞功能，影响骨吸收[3-4]。因此，本研究通过观察双膦酸盐类联合他汀类药物对骨质疏松大鼠骨组织Wnt/β-catenin信号通路相关因子的影响，进一步揭示双膦酸盐和他汀类药物防治OP的相关分子生物学机制，以期为OP防治提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料

阿仑膦酸钠片(福善美)(70 mg/片，生产批号：J20190085)和辛伐他汀片(舒降之)(20 mg/片，生产批号：J20190621)均购于美国默沙东制药有限公司，Wnt、β-catenin、Runx-2多克隆抗体购于美国R&D公司。PCR试剂盒购于英国Abcam公司，双能X线骨密度仪购于美国Norland公司，骨生物力学实验仪购于日本岛津公司。

1.2 方法

1.2.1实验动物与分组：65只3月龄，体重(350±30) g，雌性SD大鼠，购于安徽医科大学动物实验中心，将大鼠予以国家标准(温度：20 ℃～25 ℃，湿度：60%～70%，12 h间隔正常照明)分笼饲养，自由饮食摄水。按数字表完全随机化分组：对照组、模型组、A药组(阿仑膦酸钠组)、B药组(辛伐他汀组)、A+B药组(阿仑膦酸钠联合辛伐他汀组)。对照组不作任何处理，其余4组大鼠均行骨质疏松模型。

1.2.2大鼠骨质疏松造模与药物处理：参考文献[5]采用双侧卵巢切除术方法构造骨质疏松大鼠动物模型。术后第3天均采用灌胃方式给药，对照组和模型组：(同等量0.9% Nacl)，A药组：[(福善美 0.5 mg/(kg·d)]，B药组：[舒降之 4 mg/(kg·d)]，A+B药组：[福善美 0.5 mg/(kg·d)，舒降之 4 mg/(kg·d)]，连续用药8周。

1.2.3取材及标本处理：采用快速心脏急性大失血法处死大鼠，取血约6～8 mL，离心，3 000 r/min×15 min，收集上层血清1～2 mL，-20 ℃保存备用。逐层剥离腰椎及股骨，以0.9%Nacl湿纱布包裹待BMD检测，测定完毕后迅速转入液氮，用于RT-PCR和Western blot检测。另留取胫骨10%甲醛溶液固定，10% EDTA 脱钙6周，制作石蜡切片，保存备用。

1.2.4骨组织骨密度(BMD)测定：取出待测腰椎和股骨，采用DPX-L型双能X线骨密度扫描仪，采用小物体扫描模式(类型：hHi-Res、精度：1%、速度：50 mm/s、宽度：5.0 cm、分辨率：1.0 mm×1.0 mm)等参数值，选定兴趣区连续检测5次，求其均值，软件分析计算BMD值。

1.2.5骨组织骨生物力学指标测定：将骨组织置于电子万能生物力学万能材料试验机，固定骨标本位置，均取同一体位，保持标本上下面水平，压点处于骨中间位置的正上方，自上往下加载下压直至骨断裂，(跨距：24 mm，速度：2 mm/min，量程：1 000 N)，记录仪记录载荷-变形曲线。

1.2.6实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测骨组织Wnt、β-catenin和Runx2的mRNA表达：取股骨组织30 mg，参照PCR试剂盒说明书逐步操作，Trizol法提取总RNA，依据Prime ScriptTM reagent逆转录试剂盒以获得cDNA，PCR热循环仪扩增。扩增条件：93 ℃预变性5 min；95 ℃变性2 min，75 ℃退火40 s，60 ℃延伸60 s，共45循环。β-catenin为内参照基因，采用2-ΔΔCt法计算各基因相对表达量。基因引物序列见表1。

1.2.7Western blot检测骨组织Wnt、β-catenin和Runx2蛋白表达：取出股骨组织20 mg，添加液氮研磨，添加细胞裂解液，提取总蛋白，以GAPDH为内参，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，参照Western blot检测步骤进行操作，对目的条带进行扫描分析。

1.2.8HE染色观察骨组织形态学：参照HE染色法逐步操作，苏木精染色5 min，盐酸酒精碱化10 s，伊红染液染色1～2 min，光镜下观察并采集图片。

表1 qRT-PCR扩增引物序列Table 1 qRT-PCR amplification primer sequences

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 各组骨组织BMD

模型组较对照组BMD(腰椎、股骨)均显著降低(P<0.05)，A药组、B药组和A+B药组较模型组BMD(腰椎、股骨)均显著增高(P<0.05)，以A+B药组最高，见表2。

表2 各组大鼠骨组织Table 2 BMD of bone tissue in each group

2.2 各组骨组织生物力学

模型组较对照组最大载荷和最大应力(腰椎、股骨)均显著降低(P<0.05)，A药组、B药组和A+B药组较模型组最大载荷和最大应力(腰椎、股骨)均显著增高(P<0.05)，以A+B药组最高。见表3。

表3 各组大鼠骨组织生物力学指标比较Table 3 The biomechanical indexes of bone tissue in each group

2.3 各组骨组织Wnt、β-catenin和Runx2 mRNA表达

模型组较对照组骨组织Wnt、β-catenin和Runx2 mRNA均显著降低(P<0.05)，A药组、B药组和A+B药组较模型组骨组织mRNA均显著增高(P<0.05)，以A+B药组最高。见表4。

表4 各组大鼠骨组织Wnt、β-catenin和Runx2 mRNA比较

2.4 各组骨组织Wnt、β-catenin和Runx2蛋白表达

模型组较对照组骨组织Wnt、β-catenin和Runx2蛋白均显著降低(P<0.05)，A药组、B药组和A+B药组较模型组骨组织蛋白均显著增高(P<0.05)，以A+B药组最高。见图1和表5。

图1 Western blot检测各组骨组织Wnt、β-catenin和Runx2蛋白表达Fig.1 Western blotting analysis of Wnt, β-catenin, and Runx2 protein expression in bone tissue of each group

表5 各组大鼠骨组织Wnt、β-catenin和Runx2蛋白比较

2.5 骨组织形态学

对照组胫骨骨小梁形态结构完整，粗壮饱满、丰富均匀致密，排列紧密规整，小梁间连接呈网状，骨髓腔较小，骨髓细胞数量丰富。模型组骨小梁形态结构差，数量明显减少，细薄，排列紊乱，部分出现断裂现象，骨髓腔明显变大。A药组、B药组和A+B药组骨小梁结构较前完整，数量增多，粗壮饱满，排列尚规则，连续完整性较好，骨小梁间隙略有增大，且A+B药组骨小梁结构较双膦酸盐组和他汀组明显改善。见图2。

图2 HE染色观察胫骨骨组织的形态结构(×200)A：对照组；B：模型组；C：A药组；D：B药组；E：A+B药组Fig.2 Observation of morphological structure of the tibia with HE staining (×200)A: Control group; B: Model group; C: Drug group A; D: Drug group; E: Drug group A+B

3 讨论

成骨细胞和破骨细胞共同作用影响着骨骼生长、发育和代谢等一系列过程，成骨细胞和破骨细胞相互耦联、相互作用形成骨吸收和骨形成之间的平衡，影响骨骼持续重建过程，维持骨骼的平衡性和完整性[6]。OP由成骨细胞骨形成作用和破骨细胞骨吸收作用之间的动态平衡被破坏，骨形成缓慢，骨吸收增强，骨吸收强于骨形成，而引起骨重建失衡[7-8]。众多细胞因子调控的信号通路，通过调控骨形成或骨吸收过程信号通路中的相关因子，以改善骨重建失衡状态[9]。经典Wnt/β-catenin信号通路通过直接影响成骨细胞增殖、分化和凋亡，间接影响破骨细胞功能，在骨形成与骨吸收等骨重建方面起着十分重要作用，是当前骨质疏松性疾病的研究热点。

阿仑膦酸钠是首个获得FDA批准用于治疗OP的第3代双膦酸盐类骨吸收抑制剂药物[10]。他汀类药物属3-羟基3-甲基戊二酰辅酶A抑制剂[11]。辛伐他汀通过促进Wnt蛋白与其受体Frz及辅助受体LRP5/6结合形成复合物，活化Fz受体，抑制胞质β-catenin的降解，β-catenin累积并进入细胞核与核内转录因子TCF/LEF结合，而激活下游相关靶基因Runx2、Osx、c-myc等因子的转录和表达[12-13]。以促进成骨细胞增殖和活化，并调节BMSC向成骨细胞分化，同时抑制成骨细胞凋亡，促进骨形成，抑制骨吸收，维持骨重建过程，从而发挥抗OP作用[14]。

本研究结果表明阿仑膦酸钠联合辛伐他汀药物组较模型组骨组织BMD、最大载荷和最大应力均显著升高；阿仑膦酸钠联合辛伐他汀药物组较模型组骨组织Wnt、β-catenin、Runx2 mRNA和蛋白表达均显著升高。阿仑膦酸钠联合辛伐他汀药物组骨小梁结构完整，数量增多，排列规则。表明阿仑膦酸钠联合辛伐他汀能具有协同通过激活经典Wnt/β-catenin信号通路增加去势大鼠的Runx2的表达，促进成骨细胞的增殖和分化，能够改善骨代谢，从而达到防治OP目的，Wnt/β-catenin信号通路是两类药物防治OP主要作用机制。同样，张磊等[15]研究发现辛伐他汀通过促进Wnt/β-catenin信号通路相关因子，促进BMSCs向成骨细胞分化。梁耀中等[16]研究表明阿伐他汀通过上调Wnt/β-catenin表达，促进骨质疏松大鼠骨整合。同时诸多研究[17-18]表明阿仑膦酸钠、辛伐他汀两药联合可改善骨质疏松骨代谢生化指标，增加骨密度，具有协同抗骨质疏松作用。

综上所述，本研究初步认为双膦酸盐和他汀类药物可能通过调控经典Wnt/β-catenin信号通路，激活该通路相关因子的表达，增加去势骨质疏松大鼠骨密度，提高骨生物力学性能，改善骨组织结构，从而发挥对OP防治作用。但两类药物调控Wnt/β-catenin经典信号途径的具体详细作用机制还有待深入研究，相信随着Wnt/β-catenin信号途径作用机制的逐渐阐明，也将推动此类药物防治OP研究进展，为防治OP提供新思路和新方法。