基于网络药理学探讨枸杞子-山药防治阿尔茨海默病的作用机制

杨 梦，鲜慈英，黄 斌，凌志峰，赵 倩，詹 杰，罗洪斌,2,3*

1.湖北民族大学医学部(湖北 恩施 445000)

2.湖北民族大学神经精神共患病研究所(湖北 恩施 445000)

3.湖北恩施学院(湖北 恩施 445000)

阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease，AD)是一种与年龄相关的、进行性的、不可逆转的神经退行性疾病，以认知和记忆障碍为特征，是老年痴呆的最常见疾病[1]，主要病理改变是以细胞内的神经原纤维缠结和细胞外的老年斑形成[2]。2015年世界AD报告指出[3]，全球每3 s有1例新发AD患者被诊断，到2050年，全球老年痴呆患者将从目前4 600万人增加至1.315亿。AD归属为中医学中老年痴呆的范畴，以补肾益智、调养五脏为主要的治疗原则。枸杞子(lycium barbarum)是茄目茄科枸杞属植物，又名“却老子”，具有补肝益肾、益精明目等功效。枸杞子在《神农本草经》中被列为上品，称其为“久服轻身不老、耐寒暑”[4]。现代医学研究发现[4-5]，枸杞子主要活性成分有枸杞多糖、多酚和类胡萝卜素等，具有抗衰老、神经保护、抗AD、抗氧化和保肝等作用。据文献报道[6]，枸杞子可增加AD小鼠自主活动试验中的水平和垂直运动量，提高旋转木马试验中的耐力时间并降低Morris水迷宫试验中的逃逸潜伏期。枸杞子被证实能改善AD动物模型的认知功能，且在延缓衰老相关认知障碍和改善健康方面具有强大潜力[7]。山药(chinese yam)为薯蓣科薯蓣属多年生缠绕性藤本薯蓣的根茎，具有补脾养胃、生津益肺等功效。研究发现[8]山药含有丰富的蛋白质、人体必需的氨基酸、多种微量元素、多糖、胆碱、甾醇等多种营养成分及功能因子，其中，多糖是其主要成分，具有降血糖、降血脂、抗氧化、抗衰老、增强免疫和抗肿瘤等功效。张松峰等[9]报道认为山药、枸杞子为主的药对是符合药食同源类中药从虚防治AD的基本食疗配伍规律并在临床得到广泛应用。本文运用网络药理学的方法筛选出枸杞子-山药的有效成分、作用靶点及信号通路，进一步明确其防治AD的作用机制，为AD的治疗提供新思路。

1 资料与方法

1.1枸杞子、山药化学成分査询及筛选在中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP：Traditional Chinese Medicine System Pharmacology Database,http://tcmspw.com/tcmsp.php)中査询枸杞子、山药组分，以口服生物利用度(Oral Bioavailability,OB)≥30%且类药性(Drug Likeness，DL)≥0.18 为标准进行初步筛选[10]。其中，OB是影响药效的关键因素，它反映了药物经吸收进入循环血液的量，OB≥30%说明药物有较好吸收。DL是指化合物与已知药物的相似性，DL≥0.18说明化合物有较好的成药可能性。

1.2基因标准化通过Uniprot(https://www.uniprot.org/)数据库将靶点蛋白名称转换成基因名，选择人源靶蛋白。

1.3收集疾病基因在GeneCards(https://www.genecards.org/)数据库中以“Alzheimer’s disease”作为关键词查找与AD相关的靶点基因。

1.4网络构建利用Cytoscape 3.7.2软件绘制疾病-药物-靶点-基因网络关系图。利用STRING(https://string-db.org/)数据库构建PPI基因相互作用网络图，然后利用R×64 3.6.3及Perl脚本构建枸杞子-山药防治AD的PPI核心靶点基因。

1.5生物功能和富集功能分析利用R×64 3.6.3及Perl脚本进行程序运算，对筛选出的基因做GO分析和KEGG分析。

2 结果

2.1枸杞子、山药化学成分筛选共筛选出枸杞子的候选化合物96个，山药的37个，它们分别具有444、190个靶点，见表1。

表1 枸杞子-山药化合物的基本信息

2.2收集疾病靶点以及候选化合物靶点预测通过GeneCards数据库检索与AD相关基因，共8 718个基因，后取Relevance score≥17进行筛选。通过Uniprot数据库的检索，去除非人源靶蛋白后，共得到506个基因。

2.3构建疾病-药物-靶点-基因网络将疾病与靶点取交集，共取得79个交集基因。据Cytoscape 3.7.2软件作图结果显示，该网络由111个节点组成，包括29个成分节点、79个基因节点、2个药物节点及1个疾病节点，见图1。此外，排名前5位的分别是槲皮素(quercetin)、β-谷甾醇(β-sitosterol)、芸香素(rutin)、黄豆素黄酮(glycitein)、薯蓣皂甙元(diosgenin)等，这些有效成分可能是枸杞子-山药防治AD的最关键成分。

注：红色节点：疾病；浅绿色节点：药物；深绿色节点：基因；紫色：成分

2.4构建PPI网络图及PPI核心靶点图将交集基因导入STRING数据库，选择物种为人，构建PPI网络图，见图2。在GQZ-SY防治AD的PPI核心靶点基因图中，INS、AKT1、CASP3、IL6、MAPK1、TNF是关联度值最大的前6个节点，这6个节点可能是GQZ-SY防治AD的重要靶点，可能在防治AD中发挥关键作用，见图3。

图2 GQZ-SY防治AD的PPI基因相互作用网络图

注：数字=节点度

2.5生物功能和通路富集分析将GQZ-SY防治AD可能发挥作用的基因靶点进行GO分析及KEGG分析，见图4-5。在GO分析中得到GQZ-SY作用于AD条目2 355个，其中生物过程(Biological Process，BP)条目2 167个，分子功能(Cellular Component，CC)条目62个，细胞组分(Molecular Function，MF)条目125个。BP涉及了活性氧代谢过程、对脂多糖的反应、对细菌来源分子的反应、氧化应激反应、外源性凋亡信号通路、活性氧物种生物合成过程等。CC涉及了膜微区、膜区等。MF涉及了磷酸酶结合、细胞因子受体结合、蛋白磷酸酶结合等。

图4 GQZ-SY防治AD的GO功能富集分析柱状图

图5 GQZ-SY防治AD的KEGG通路富集分析柱状图

KEGG分析得出MAPK信号通路、PI3K-AKT信号通路、VEGF信号通路、IL-17信号通路、TNF信号通路、HIF-1信号通路等，其中，MAPK信号通路是与AD机制研究密切相关的通路，也可能是GQZ-SY通过其发挥作用改善认知功能障碍的重要信号通路。MAPK信号通路包含了经典的MAPK通路、c-Jun N端激酶(JNK)和P38 MAPK通路、蛋白激酶5(ERK5)通路，本次研究所涉及到的蛋白有胱天蛋白酶(CASP)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT)、人体抑癌基因(P53)、P38蛋白(P38)、蛋白激酶C(PKC)、TNF等，见图6。

图6 MAPK信号通路

3 讨论

关于AD的研究有Tau蛋白过度磷酸化假说、Aβ沉积假说、炎症假说、神经递质失调假说、基因突变假说等，然而这些假说尚不能够清晰解释该病的发病机理。AD的发生与年龄、性别、教育等因素息息相关，同时伴随着老龄化社会的到来，患病人数日益增加，因此亟待开发可有效防治AD的药物。

王翠等[11]研究发现，槲皮素不仅对原代培养的初生大鼠海马和皮层神经元具有雌激素样保护作用，还可拮抗Aβ25-35诱导的PC12细胞损伤，其机制可能是通过激活PI3K/AKT信号通路，抑制下游靶分子GSK3β活性，发挥神经保护作用。富含β-谷甾醇的食物，可有效预防AD的发生[12]。薯蓣皂甙元能显著改善个体动物的认知能力，有效减少大脑皮层和海马的淀粉样斑块和神经纤维缠结，并有效拮抗仅在淀粉样斑块密切相关区域观察到的退化轴突和突触前终末的减少[13]。CASP3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶，也是细胞毒性T淋巴细胞杀伤机制的重要组成部分。IL-6是另一种功能广泛的多效性细胞因子，可调节多种细胞的生长与分化、参与免疫应答、急性期反应及造血功能，并在机体抗感染免疫反应中起重要作用。TNF-α主要由活化的巨噬细胞，NK细胞及T淋巴细胞产生，其在体内外实验中都表现出杀瘤或抑瘤作用和免疫调节活性。GQZ-SY防治AD的生物过程主要有活性氧代谢、氧化应激反应、外源性凋亡通路等。神经元凋亡是AD的主要特征之一，半胱天冬酶与神经纤维缠结的形成呈正相关[14]，半胱天冬酶一旦被激活，便可导致神经细胞过度凋亡。

MAPK信号通路是生物体内重要的信号转导系统之一，参与介导细胞生长、发育、分裂和分化等多种生理及病理过程。MAPK家族的信号通路主要包括细胞外信号调控的蛋白激酶(ERK)、JNK/应激激活的蛋白激酶(SAPK)、P38 MAPK以及蛋白激酶5/大丝裂原活化蛋白激酶1(ERK5/BMK1)4条途径[15]。MAPK通路与神经突触可塑性、神经细胞生长、神经炎症、细胞凋亡等均有关系[1]。p38 MAPK抑制剂可保护血管性痴呆大鼠的行为学能力和形态结构并调控脑海马区多种氨基酸的表达[16]。其中，ERK指导神经发生迁移和神经祖细胞的最终命运，参与树突的成熟过程和突触形成、行为学以及记忆过程。PI3K/AKT信号通路参与细胞生长、发育、自噬等过程，与神经退行性疾病关系密切，而AKT、GSK-3β是这条通路上重要的靶标蛋白，正确调控它们的表达，有助于保护和促进神经元发育。

课题组后续可参考本次预测结果来进行设计体内外实验以进一步挖掘GQZ-SY防治AD的作用机制，提供基础数据支持并推动临床应用。本研究尚存在一定的局限性，研究策略差异、数据库收纳信息、再加上网络药理学部分研究有忽略中药成分的含量和浓度问题等，均会产生预测结果的不同。

综上所述，GQZ-SY可能通过多成分、多靶点、多通路间的相互影响、相互协同而发挥防治AD的作用，多与保护神经元、减轻炎症反应、参与免疫调节等功能密切相关。